Phạm Quang Thu

Trần Thanh Trăng

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Thông (Pinus spp.) là loài cây có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, gỗ thông được dùng trong công nghiệp chế biến giấy, làm bao bì, các công trình xây dựng, đồ gỗ trang trí nội thất; nhựa thông được dùng trong công nghiệp điện tử. Ngoài ra, thông còn được sử dụng trong việc phủ xanh đất trống đồi núi trọc, trồng rừng phục vụ phòng hộ và tạo cảnh quan môi trường. Theo số liệu kiểm kê rừng Việt Nam, đến năm 1999 tổng diện tích rừng trồng cả nước là 1.471.394 ha, trong đó diện tích rừng trồng thông là 218.056 ha chiếm 14,8%. Hiện nay, cây thông được xem như cây trồng chính được lựa chọn cho Chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng của Nhà nước. Trong thực tế sản xuất, cây thông con ở vườn ươm thường bị bệnh thối nhũn (damping-off) với 4 triệu trứng điển hình: thối mầm hạt, đổ gục, chết đứng và khô đầu lá do các loài nấm Fusarium spp., Phytophthora spp., Rhizoctoia spp., Pythium spp. … gây ra làm thiệt hại rất lớn cho sản xuất cây con ở vườn ươm cũng như chất lượng cây thông con khi đưa đi trồng rừng. Trong sản xuất, người ta cũng đã áp dụng nhiều biện pháp để ngăn chặn sự phá hại của dịch bệnh như gieo ươm hạt thông vào thời vụ không thích hợp với sự phát triển của nấm bệnh hoặc dùng thuốc hoá học Benlate để phòng trừ. Thực tế cho thấy các biện pháp này tỏ ra không đạt được hiệu quả cao, không kiểm soát được dịch bệnh do không chủ động được về thời tiết và do dùng một loại thuốc đã hình thành tính kháng thuốc ở các loài nấm bệnh; ngoài ra, biện pháp hoá học còn gây tác hại xấu đối với sức khoẻ con người và môi trường.

Xuất phát từ thực tế trên, ở Việt Nam cũng đã có nhiều tác giả đi sâu vào việc phân lập các vi sinh vật như vi nấm (Trichoderma spp), xạ khuẩn (Actinomyces spp., Streptomyces spp.) và vi khuẩn (Bacillus spp.) từ môi trường đất hoặc nước có khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh và nghiên cứu tách chiết và sử dụng các chất kháng sinh, sản xuất chế phẩm phục vụ việc phòng trừ các sinh vật gây bệnh cho thực vật.

Để góp phần hạn chế sự phát triển của dịch bệnh đối với cây thông chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của các loài thực vật (endophytic bacteria) sản sinh ra các chất kháng sinh trong quá trình trao đổi chất có khả năng ức chế sự phát triển của các loài nấm hại gây bệnh thối nhũn cây con trong giai đoạn gieo ươm ở vườn ươm.

Trong khuôn khổ của bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập vi khuẩn sống trong mô của 12 loài thực vật và kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của 2 loài nấm gây bệnh nguy hiểm là Fusarium oxysporum và Phytophthora spp.

1. Vật liệu và phương pháp

1.1. Vật liệu

– Các loài cây được dùng để lấy mẫu phân lập vi khuẩn:

1. Sao đen (Hopera odorata Roxb),

2. Tếch (Tectona grandis Linn.f.),

3. Mẫu đơn (Gardenia lucida),

4. Râm bụt (Hibiscus macrophylla),

5. Giẻ xanh (Lithocarpus tubulosus),

6. Bằng lăng (Largerstroemia calyculata),

7. Ngâu đỏ (Aglaia rubescens),

8. Liễu (Salix babylonia),

9. Keo tai tượng (Acacia mangium),

10. Keo lá tràm (Acacia auriculiformic),

11. Côm tầng (Elaeocarpus griffithii),

12. Lát hoa (Chukrasia tabularis A. Juss).

– Nấm Fusarium oxysporum: được phân lập từ cây thông mã vĩ (Pinus massoniana Lamb) bị bệnh ở vườn ươm Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc Bộ – Đại Lải – Vĩnh Phúc.

– Nấm Phytophthora sp.: Được phân lập từ mẫu cây thông bị bệnh ở Đà Lạt.

1.2. Phương pháp nghiên cứu

– Phân lập vi khuẩn: Các mẫu cây được ngâm khử trùng trong dung dịch cồn 70% và được cắt thành các miếng nhỏ có kích thước 0.5×1 cm. Sau đó các miếng nhỏ này được đặt trong các ống nghiệm chứa 1 ml môi trường PBS và đưa lên máy lắc, lắc trong khoảng 4 giờ với tốc độ 250 vòng/phút và ở nhiệt độ 28^oC loại bỏ mẫu vật cấy chuyển dung dịch của môi trường PBS trên các đĩa môi trường King B, để ở nhiệt độ 28^oC, sau 48 giờ vi khuẩn mọc lên. Cấy chuyển các khuẩn lạc mọc riêng rẽ với các hình thái phân biệt trên các đĩa môi trường King B khác, nuôi vi khuẩn trong điều kiện nhiệt độ 28^oC.

– Phân lập nấm bệnh Fusarium và Phytophthora: Các loại nấm bệnh này được phân lập từ các mẫu cây bị bệnh và nuôi cấy trên môi trường PDA.

– Tuyển chọn: Các mẫu vi khuẩn sau khi phân lập được cấy trên các đĩa môi trường PDA, để ở nhiệt độ 28^oC từ 5 đến 7 ngày đủ thời gian cho vi khuẩn sản sinh ra chất kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh ra môi trường PDA. Sau đó các vi khuẩn được tách ra khỏi các đĩa môi trường PDA và các mẫu nấm bệnh được cấy 3 điểm vào sát mép của đĩa Petri. Sau 5-7 ngày đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển nấm bệnh của vi khuẩn trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế. Đường kính vòng ức chế được tính bằng công thức sau:

V (mm) = D (mm)– d (mm)

Trong đó: – D là đường kính trung bình vòng ức chế sự phát triển của nấm bao quanh khuẩn lạc tính theo 2 chiều vuông góc.

– d là đường kính trung bình tính theo 2 chiều vuông góc của khuẩn lạc.

2. Kết quả nghiên cứu

2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn

Với 12 loài cây dùng để lấy mẫu phân lập vi khuẩn, chúng tôi đã phân lập được trên 70 chủng vi khuẩn khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 1.

Bảng 1 Kết quả phân lập vi khuẩn

Số TT	Loài cây	Số lượng vi khuẩn phân lập được	Ký hiệu chủng vi khuẩn
1	Sao đen	6	N1 – N6
2	Tếch	5	SP101 – SP105
3	Mẫu đơn	10	MD1 –MD10
4	Râm bụt	5	SP311 – SP315
5	Giẻ xanh	4	SP41 – SP44
6	Bằng lăng	7	SP511 – SP515
7	Ngâu đỏ	8	SP11 – SP18
8	Liễu	6	SP211 – SP216
9	Keo tai tượng	4	SP161 – SP165
10	Keo lá tràm	5	SP611 – SP615
11	Côm tầng	5	SP811 – SP815
12	Lát hoa	5	SP911 – SP915
Cộng	70

2.2. Kết quả tuyển chọn

Qua quá trình làm thí nghiệm thử hiệu lực của vi khuẩn trên môi trường PDA, 11 chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh chất kháng sinh gây ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và Phytophthora sp. đã được tuyển chọn trong tổng số 70 chủng vi khuẩn. Khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn đối với 2 loài nấm bệnh sau 5 ngày nuôi cấy được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn đối với

nấm Fusarium oxysporum và Phytophthora sp.

STT	Ký hiệu chủng vi khuẩn	Đường kính vòng ức chế (mm)
*Fusarium*	*Phytophthora*
1	SP16	20	15
2	SP43	25	20
3	SP111	19	22
4	SP215	17	11
5	SP18	20	30
6	SP14	30	18
7	SP213	14	15
8	SP161	20	16
9	SP162	24	20
10	MD2	30	30
11	N1	17	12

Bảng số liệu trên cho thấy các chủng vi khuẩn khác nhau có hiệu lực trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh khác nhau. Chủng mang ký hiệu MD2, SP14 có hiệu lực rất cao đối với khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và chủng MD2, SP18 có hiệu lực cao đối với nấm Phytophthora sp. Chủng MD2 có hiệu lực cao đối với cả hai loài nấm bệnh trong thí nghiệm.

ảnh1 Khả năng gây ức chế sự phát triển nấm bệnh Fusarium oxysporum

của một số chủng vi khuẩn

2.3 Mô tả một số đặc điểm của 3 chủng vi khuẩn có hiệu lực cao

– Đặc điểm của chủng vi khuẩn MD2:Tế bào có dạng hình cầu, đứng riêng rẽ, di động; kích thước tế bào: chiều dài từ 2,4-2,7mm; đường kính từ 1,2-1,5mm; khuẩn lạc hình đa giác, nhẵn, hơi nhày, có màu trắng đục, có đường đồng tâm mờ ở mép ngoài, đường kính khuẩn lạc sau 5 ngày: 10 mm.

– Đặc điểm của chủng vi khuẩn SP18:Tế bào có dạng hình cầu, đứng riêng rẽ; di động, kích thước tế bào: chiều dài từ 1,7-2,5mm, đường kính từ 0,7-1mm; khuẩn lạc có màu nâu ở giữa, mép ngoài màu nâu đục, hình thù không cố định, có đường đồng tâm ở giữa, hơi khô, kích thước khuẩn lạc sau 5 ngày: 14mm.

– Đặc điểm của chủng vi khuẩn SP14: Tế bào có dạng hình cầu, đứng riêng rẽ, kích thước tế bào: chiều dài từ 1,1-1,3mm, đường kính từ 0,7-0,8mm, khuẩn lạc có màu trắng ngà, nhày, hình tròn, nhẵn, có đường đồng tâm mờ từ giữa ra mép ngoài, đường kính khuẩn lạc sau 5 ngày: 12mm.

3. Kết luận

Thí nghiệm đã phân lập được 70 chủng vi khuẩn sống trong mô của 12 loài thực vật.

· Tuyển chọn được 11 chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh ra chất kháng sinh gây ức chế sự phát triển của nấm bệnh.

Chủng MD2 phân lập từ cành cây mẫu đơn và SP14 phân lập được từ cành cây ngâu đỏ có hiệu lực cao nhất trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh Fusarium oxysporum và chủng MD2 và SP18 phân lập từ cành cây ngâu đỏ có hiệu lực cao nhất trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh Phytophthora.
Chủng MD2 có hiệu lực cao nhất trong việc ức chế sự phát triển của cả 2 loại nấm bệnh.

Tài liệu tham khảo

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998, Vi sinh vật học, nhà xuất bản Giáo dục, 1998.

Jinwi Kim, 2000, Isolation and purification of antifungal compound and b-lactamase inhibitor from endophytic bacteria, Ms Thesis, SNU, 2000.

Phạm Văn Mạch, 1991, Góp phần nghiên cứu bệnh thối nhũn (Damping off) cây con thông nhựa (Pinus merkusians E.N.G. Cooling H. Gaussen) và Thông caribe (Pinus caribaea Morelet) tại một số vùng ở miền Bắc Việt Nam. Luận văn Phó tiến sỹ, Hà Nội, 1991.

Summary

In the process of sowing of pine in the nursery, the seedlings usually suffer from damping-off disease causing great loss to production. In contribution to diminishing the loss caused by this disease by biological measures, strains of endophytic bacteria that are capable of producing antibiotic inhibiting the growth of pathological fungi are isolated and selected. 70 bacterial strains have been isolated from 12 plant species and there selected 11 bacterial strains that can inhibit the growth of 2 pathological fungi: Fusarium oxysporum and Phytophthora sp. Of which 3 trains MD₂, SP₁₄ and SP₁₈ are very effective. Strains MD₂ and SP₁₄ produce an inhibiting circle 30m.m in diameter to Fusarium oxysporum and MD₂ and SP₁₈ also produce an inhibiting circle 30m.m in diameter to Phytophthora sp.. MD₂ strain is capable of inhibiting the growth of both pathological fungi.