Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Lương Thị Hoan,

Ngô Thị Minh Duyên, Nguyễn Thiên Hương

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

Nuôi cấy mô là phương pháp khá phổ biến để nhân nhanh các loài cây trồng chất lượng cao. Trong lâm nghiệp phương pháp này đã được áp dụng tương đối sớm ở một số nước tiên tiến như Pháp, Đức, Braxin, Trung Quốc… để nhân nhanh một số giống có năng suất cao.

ở Việt Nam công nghệ này đã được du nhập vào cùng với một số dòng Bạch đàn từ Trung Quốc vào năm 1992 cho một số đơn vị lâm nghiệp nhằm nhân nhanh các giống ưu trội phục vụ sản xuất.

Gần đây, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã chọn tạo được một số giống có năng suất và chất lượng cao hơn hẳn các giống đang sử dụng trong sản xuất, trong đó có một số tổ hợp lai giữa các loài Keo và Bạch đàn. Những giống này đáp ứng được yêu cầu cấp bách về trồng rừng và sản xuất nguyên liệu…

Nuôi cấy mô là phương pháp có khả năng nhân nhanh một số lượng lớn, đảm bảo giữ được các đặc điểm di truyền tốt và giữ được tính trẻ hoá. Đây là phương pháp tốt nhất để giải quyết nhu cầu cây con phục vụ trồng rừng sản xuất trên quy mô lớn với độ đồng đều cao, đáp ứng yêu cầu sản xuất công nghiệp, góp phần thực hiện có hiệu quả chương trình trồng mới 5 triệu hecta rừng.

1. Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Đối tượng.

– Keo lai (A. mangium X A. auriculiformis). : dòng BV10

– Keo lá tràm (Acaia auriculiformis): dòng 83.

– Bạch đàn lai (E.urophyllaX E.camaldulesis): tổ hợp lai U₂₉C₃

Vật liệu.

– Là các đoạn chồi gốc dài 10-15cm của cây con 6 tháng đến 1 năm tuổi được dẫn giống từ các cây trội đã qua chọn lọc.

Khử trùng bề mặt.

Mẫu vật được khử trùng qua các bước sau:

– Rửa qua vòi nước chảy liên tục.

– Xử lý bằng các chất tẩy nhẹ.

– Lau bằng cồn 70⁰.

– Tráng bằng nước cất vô trùng.

– Khử trùng bằng HgCl₂0.1%trong các thời gian khác nhau.

Môi trường nuôi cấy.

Làmôi trường Murashige & Skoog cải tiến (MS*) có bổ xung một số chất điều hoà sinh trưởng thuộc hai nhóm Auxin , Cytokinin và chất phụ gia , các Vitamin đường, A ga vừa đủ.

Điều chỉnh pH= 5.8 với Keo lai và Keo lá tràm, pH= 5.8-6.0 đối với môi trường nuôi cấy Bạch đàn.

Thời gian hấp khử trùng 20 phút (1.2 kg/ cm³ tại 121⁰C).

Điều kiện nuôi cấy.

Chế độ ánh sáng 3000lux chiếu sáng10 giờ 1 ngày, nhiệt độ 25 ±2⁰C đối với Keo lai và Keo lá tràm.

Chế độ ánh sáng 2000lux chiếu sáng8 giờ 1 ngày, nhiệt độ 27 ±2⁰C đối với Bạch đàn

Các thí nghiệm đều được bố trí nhiều lần lặp và xử lý kết quả theo phương pháp thống kê thông thường.

2. Kết quả nghiên cứu.

Khử trùng.

Các đoạn chồi được xử lý bằng dung dịch HgCl₂ 0,1 với thời gian 2′, 4′, 6′,8′, 10′, 12′.(phút)

Kết quả cho thấy xử lý 12′ tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ bật chồi của Keo lai và Bạch đàn lai đều bằng 0. Điều đó chứng tỏ ở thời gian này HgCl₂ đã thấm sâu vào tế bào chất, phá huỷ chất nguyên sinh, ảnh hưởng tới mọi quá trình trao đổi chất của tế bào

Xử lý HgCl₂ từ 2- 4 phút cho cả 3 đối tượng trên tỷ lệ nhiễm tăng chứng tỏ ở thời gian xử lý thấp, chưa đủ loại trừ một số nấm bệnh, bụi bẩn bám trên mẫu vật.

Với Bạch đàn thời gian xử lý từ 6-8 phút cho kết quả cao tỷ lệ nhiễm giảm hẳn chỉ còn 20-24%, tỷ lệ bật chồi đạt 38-60%. Riêng Keo lai và Keo lá tràm thời gian xử lý từ 8-10 phút đạt hiệu quả cao nhất tỷ lệ nhiễm 48%, tỷ lệ bật chồi tăng đạt tới 60%.

Thời gian thu mẫu trong năm cho Keo lai và Bạch đàn vào vụ Hè -Thu thích hợp nhất. Riêng với Keo lá tràm vụ Xuân-Hè là thích hợp, vì ở thời gian trên cây ít bị nấm bệnh hơn.

Nhân chồi.

Sau 10-15 ngày cấy, các chồi bất định xuất hiện, khi chiều cao đạt 1,5-2cm chồi được tách ra, cấy vào môi trường MS cải tiến (MS*) có bổ xung: BAP (6-benzyl- amino purine), Kn (kinetin), ở các nồng độ khác nhau.

Kết quả thí nghiệm cho thấy khi dùng riêng rẽ thì BAP tỏ ra là thích hợp hơn cả trong việc kích thích tạo chồi cho cả 3 đối tượng Keo lai, Bạch đàn lai và Keo lá tràm.

Môi trường MS* bổ xung BAP nồng độ 0.5mg/l thích hợp nhất cho Bạch đàn số chồi/cụm đạt trung bình 17 chồi/ cụm đặc biệt có thể tới 30 chồi/ cụm. Còn với Kn ngay cả khi hệ số nhân chồi cao nhất cũng chỉ đạt 5.6 chồi/cụm.

Trong khi đó Keo lai lại thích hợp hơn với môi trường nhân chồi MS* bổ xung BAP nồng độ 2.0mg/l cho hệ số nhân chồi 23.3.

Keo lá tràm thích hợp hơn với môi trường MS* bổ xung BAP nồng độ 1.0mg/l hệ số nhân chồi đạt 8.9.

Riêng đối với Bạch đàn hệ số nhân chồi tăng không những ảnh hưởng bởi các cytokinin được bổ xung vào môi trường nuôi cấy mà còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố khác như: chế độ ánh sáng và phương thức cấy nhân chồi. Thí nghiệm cho thấy chế độ chiếu sáng được điều chỉnh theo tỷ lệ sáng: tối: sáng tương ứng: 1:2:2 cho kết quả tốt nhất, ở chế độ này cây phát triển đều, hệ số nhân, sức sống của chồi tăng. Đặc biệt khi điều chỉnh chế độ ánh sáng theo tỷ lệ này sẽ rút ngắn thời gian giữa hai lần cấy nhân chồi từ 20-25 ngày/ lần còn 10-15 ngày/ lần cấy chuyển. Trong khi đó Keo lai và Keo lá tràm hệ số nhân chồi tăng không những chỉ ảnh hưởng bởi chất điều hoà sinh trưởng mà còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần các chất phụ gia khác trong môi trường nuôi cấy, từ đó rút ngắn được thời gian cấy chuyển.

Ra rễ.

Khi chồi đạt chiều cao từ 2.5-3 cm đối với Bạch đàn, 3-4 cm đối với Keo lai và Keo lá tràm, có thể cắt để cấy chuyển sang môi trường hình thành rễ là môi trường 1/2MS* có bổ xung IBA (axit b-indol butyric ), NAA ( axit a- naphtyl acetic).

Keo lá tràm ra rễ tốt nhất trong môi trường MS* bổ sung IBA ở nồng độ 2.0mg/l cho tỷ lệ ra rễ đạt 99.2% trong khi sử dụng NAA cùng nồng độ tỷ lệ này cũng đạt 92%. Như vậy IBA và NAA đều có tác dụng mạnh đối với quá trình ra rễ của Keo lá tràm.

Trong khi đó với Keo lai, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 98.3% khi dùng môi trường MS* bổ sung IBA nồng độ 2.0mg/l nhưng khi dùng NAA cùng nồng độ tỷ lệ ra rễ chỉ đạt cao nhất là 85.6%.

Với Bạch đàn lai môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS* bổ sung IBA nồng độ 1.5mg/l tỷ lệ ra rễ cũng đạt 97.3% trong khi dùng NAA tỷ lệ ra rễ cao nhất chỉ đạt 56%, nếu dùng kết hợp IBA và NAA tỷ lệ ra rễ cao nhất chỉ đạt 72%.

Như vậy đối với Keo lai và Bạch đàn, nếu cùng sử dụng nồng độ như nhau thì việc bổ sung thêm IBA luôn cho tỉ lệ cao hơn so với bổ sung NAA vào môi trường cấy. Do đó trong giai đoạnra rễ, invitro IBA có vai trò quan trọng, ở giai đoạn này chỉ cần bổ sung IBA riêng rẽ vào môi trường tạo rễ mà không cần sự có mặt các chất điều hoà sinh trưởng khác.

ảnh 1: Ra rễ trực tiếp keo lai bằng thuốc bột TTG

Để giảm bớt thời gian tạo rễ trong ống nghiệm, tăng khả năng chống chịu của cây trước khi đưa ra môi trường tự nhiên, các chồi có chiều cao đạt từ 3,5-4 cm được cắt xử lý bằng dung dịch Benlat nồng độ 0,3 %, chấm thuốc bột TTG (do Trung tâm Giống pha chế), cắm trực tiếp vào cát ẩm đã xử lý thuốc tím 0.15%, được chăm sóc như phương pháp giâm hom. Sau 15 ngày tỷ lệ ra rễ đạt 95%., cấy cây vào bầu đất tỷ lệ sống đạt trên 80%. Phương pháp này sẽ tận dụng nhân công, tiết kiệm được thời gian và vật tư hóa chất, hạ giá thành sản phẩm.

Ra ngôi và chăm sóc cây con.

Cây mô sau khi chiều dài rễ đạt 1.5-2.0cm ở cả 3 đối tượng được đưa ra ngoài nhà huấn luyện cho thích nghi dần với các điều kiện môi trường trong 7-10 ngày, rồi cấy vào giá thể theo 3 cách, kết quả bước đầu cho thấy:

– Cấy trực tiếp vào bầu đất + phân cămpôt, tỷ lệ sống đạt trên 90% cho cả 3 đối tượng, cây con phát triển tốt.

– Cấy trực tiếp vào bầu đất + phân NPK + xơ dừa tỷ lệ sống đạt trên 85% cho cả 3 đối tượng.

– Cấy vào bầu đất không trộn các thành phần trên, tỷ lệ sống thấp hơn, cao nhất chỉ đạt 67% với Keo lai và Keo lá tràm, riêng Bạch đàn chỉ đạt 55%.

3. Kết luận.

– Hoá chất khử trùng thích hợp cho các đối tượng trên là HgCl; với Keo lai và Keo lá tràm thời gian khử trùng là 8-10 phút, Bạch đàn là 6-8 phút. Mẫu vật được lấy từ các chồi gốc cho tỷ lệ tái sinh chồi cao, khả năng phát triển của cây tốt hơn so với mẫu vật được lấy từ các chồi cành.

– Mùa vụ thích hợp cho quá trình khử trùng với Keo lai và Bạch đàn là mùa Hè-Thu, Keo lá tràm là vụ Xuân-Hè. Thời điểm lấy mẫu thích hợp trong tuần là thứ ba đến thứ năm.

+ Bạch đàn.

– Môi trường tạo chồi thích hợp là môi trường MS* có bổ xung thêm BAP nồng độ 0.5mg/l, thời gian cấy chuyển thích hợp là 10 – 12 ngày/ lần.

– Môi trường tạo rễ phù hợp là môi trường MS* có bổ xung IBA nồng độ 1.5mg/ l.

+ Keo lá tràm.

– Môi trường nhân chồi là môi trường MS* bổ sung BAP nồng độ 1.0mg/l, thời gian cấy chuyển thích hợp là 20 – 25 ngày/ lần.

– Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS* có bổ xung IBA nồng độ 2.0 mg/ l.

+ Keo lai.

– Môi trường nhân chồi là môi trường MS* bổ sung BAP nồng độ 2.0mg/l, thời gian cấy chuyển thích hợp là 20 – 25 ngày/ lần.

– Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS* có bổ sung IBA nồng độ 2.0 mg/ l.

– Keo lai ra rễ trực tiếp bằng thuốc TTG cho tỷ lệ ra rễ cao. Tuỳ điều kiện cụ thể mà có thể sử dụng riêng lẻ hoặc phối hợp hai phương pháp ra rễ trên.

Tài liệu tham khảo

1. Lê Đình Khả, 1999, Nghiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên giữa keo tai tượng và keo lá tràm ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

2. Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai, 2003. Một số phương thức nhân giống dinh dưỡng trong sản xuất lâm nghiệp. Bộ NN&PTNT, Công nghệ nhân và sản xuất giống cây trồng, giống cây lâm nghiệp và giống vật nuôi. Nhà xuất bản Lao động-xã hội, trang 166-182.

3. Đoàn Thị Mai, Nguyễn Việt Cường, Ngô Thị Minh Duyên, Nguyễn Thiên Huơng, 2000. Kết quả bước đầu về nhân giống bạch đàn lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí Lâm nghiệp, số 10-2000, trang 46-47.

4. Đoàn Thị Mai, Ngô Thị Minh Duyên, Lương Thị Hoan, 2001. Kết quả nhân giống một số dòng keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí NN&PTNT, số 6-2001, trang 424-426.

5. Nguyễn Ngọc Tân, Trần Hồ Quang, 1997. Nhân giống lai giữa bạch đàn liễu và bạch đàn trắng bằng phương pháp nuôi cấy mô. Kết quả nghiên cứu khoa học về chọn giống cây rừng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 103-107.

Summary

Acacia hybrid (clone BV10), A,auriculiformis (clone 83) and Ecalyotus hybrid (U29C3) are good germlasm that having high yield were chosen by Research Center for Forest Tree Improvement. In order to release it for forest plantaton, vegetative propagation by tissue culture is applied.

Mercuric chloride (HgCl₂) is used to sterilize the surface of the shoot. The best reason for shoots sterilization of A.auriculifomis, Acacia and Eucalyptus hybrid are from spring to early summer and from summer to autumn, respectively.

The best growth of Acacia hybrid and A. auriculiformis responses were recorder with MS added BAP 2.0mg/l media, MS with BAP 0.5 m/l media seems to be optimum for shoot induction of Eucalyptus hybrid.

The rooting medium for Acacia hybrid and A. auriculiformis is modified MS media added IBA at concentration 2.0mg/l, The best rooting for Eucalyptus hybrid responses were observed on modified MS + IBA 0.5 mg/l media.The rooted plants were transferred to the training house maintained at 28 ±2⁰C for seven days. Thereafter, the plants were transferred to polybags containing equal quantities of soil, organic manure and other components. Depending on the weather conditions prevailing outside, the plant were kept inside polyhouse for two weeks and transferred to nursery. Following this procedure, more than 85% plants survived.