PGS. TS. Phạm Quang Thu

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của Trung Quốc, dùng chữa trị được nhiều bệnh nan y. Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục. Tại viện Nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), nấm Đông trùng hạ thảo đã được dùng để chữa liệt dương có hiệu quả tốt. Nan J.X. và đồng tác giả (2001) chứng minh nấm Đông trùng hạ thảo chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan rất có hiệu quả. Tác dụng chống ung thư được đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia trên thế giới. Dịch chiết từ thể quả có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này. Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Yoo H.S et al., 2004). Dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. et al., 2001). Dịch chiết bằng nước ấm có tác dụng kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hoá enzym caspase-3 (Lee H. et al., 2006). Thí nghiệm của Kim G.Y. và đồng tác giả (2006) cũng cho kết quả tương tự với khả năng điều trị ung thư máu của dịch chiết từ nấm. Các nhà khoa học cũng đã sử dụng dịch chiết từ loài nấm này để thử nghiệm trên các dòng tế bào bình thường và các dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy hai dòng tế bào K562 (tế bào ung thư máu-leukemia) và Du145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt-prostate carcinoma) bị ức chế mạnh bởi dịch chiết bằng dung môi butanol. Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. (2005). Ahn Y.J. và đồng tác giả (2000) cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số vi rút, vi khuẩn và nấm.

Được sự quan tâm của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn và Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã cấp kinh phí và tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện đề tài về loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris với mục tiêu chính là điều tra thành phần các loài nấm đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam, phân lập, sưu tập nguồn gen và xây dựng được quy trình nuôi trồng loài nấm này trên giá thể. Báo cáo này trình bày tóm tắt kết đã đạt được trong 2 năm từ năm 2009 đến năm 2010.

2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

– Khảo sát thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam và giám định mẫu thu được

– Xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo

– Tuyển chọn các chủng nấm Đông trùng hạ thảo phân lập được từ Việt Nam và sưu tập từ Trung Quốc và Nhật Bản có tiềm năng dược liệu

– Nghiên cứu nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo

– Nghiên cứu sấy khô thể quả

– Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể

– Xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất giống, công nghệ nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris và xây dựng mô hình nuôi trồng thể quả

2.2. Phương pháp nghiên cứu

– Khảo sát thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam và giám định mẫu thu được

Khảo sát thu mẫu được thực hiện trên tuyến điều tra ở các vùng sinh thái có độ cao trên 1000 m so với mực nước biển. Các tuyến điều tra được xác lập qua các dạng địa hình tại các khu vực sau: (i) Vườn Quốc gia Ba Vì, Ba Vì, Hà Nội; (ii) Vườn Quốc gia Tam Đảo, Tam Đảo, Vĩnh Phúc; (iii) Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Sapa và Than Uyên, Lào Cai; (iv) Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Thuận Châu, Sơn La; (v) Vườn Quốc gia Bạch Mã, Nam Đông và Phú Lộc, Thừa Thiên Huế; (vi) Vườn Quốc gia Bi Doup-Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng.

Giám định mẫu dựa trên đặc điểm hình thái, giải phẫu, đối chiếu, so sánh với chuyên khảo về Cordyceps của Gi-Ho Sung et al. (2007), Sung Jae Mo (2000), Mao X.L.(2000) và Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994). Việc phân loại nấm cũng được thực hiện bằng phương pháp sinh học phân tử, dựa trên phân đoạn 18S ARN ribosom đối với các mẫu nấm phân lập các nấm thu được ở Việt Nam và sưu tập được từ Trung Quốc và Nhật Bản.

– Xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo

Xây dựng danh mục trên cơ sở phân lập thuần khiết các chủng nấm thu được và nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết cụ thể là:

Thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng: thực hiện với 4 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau như: Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), môi trường PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), môi trường CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar). Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi).

Thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi: thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang nhiệt độ không khí khác nhau: 10⁰C, 15⁰C, 20⁰C, 25⁰C, 30⁰C và 35⁰C. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi).

Thí nghiệm về ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi: thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang ẩm độ không khí khác nhau: 60%, 70%, 80%, 90% và 100%. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi).

Thí nghiệm về ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi: thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang pH khác nhau: 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 và 8.5. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi).

– Tuyển chọn các chủng nấm Đông trùng hạ thảo phân lập được từ Việt Nam và các chủng sưu tập được từ Trung Quốc và Nhật Bản có tiềm năng dược liệu

Tuyển chọn các chủng nấm dựa vào hàm lượng cordycepin và khả năng kháng khuẩn của các chủng nấm. Xác định hàm lượng cordycepin bằng phương pháp LC/MS với chất chuẩn là authentic cordycepin hoặc xác định bằng ký lỏng HPLC với đầu dò UV có bước sóng 260nm. Sử dụng các loài nấm Candida albicans hoặc Pythium ultimum làm đối tượng xác định hiệu lực kháng khuẩn. Cấy loài nấm thử trên các hộp lồng đã có dịch nuôi cấy nấm trong các giếng. Nuôi cấy nấm trong điều kiện 25⁰C sau 12 ngày xác định đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm thí nghiệm với 10 hộp lồng và 3 lần nhắc lại.

Thí nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo được tiến hành với các chủng có hoạt tính sinh học như khả năng kháng khuẩn, cho hàm lượng cordycepin cao. Chọn các chủng có năng suất cao và thời gian nuôi cấy ngắn, thể quả to mập và màu vàng da cam, là những chủng đang được thị trường ưa chuộng.

– Nghiên cứu nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo

Thí nghiệm xác định giá thể nuôi trồng thể quả được chuẩn bị với 7 công thức sau:

Giá thể được đựng trong các bình nuôi nấm, khử trùng ở 121⁰C, thời gian 60 phút. Cấy giống nấm 7 ngày tuổi, nuôi cấy ở nhiệt độ 25⁰C trong tối. Khi sợi nấm ăn kín giá thể chiếu sáng với cường độ 700 lux với thời gian 12 giờ/ngày, độ ẩm không khí 90-95%.

Thí nghiệm được tiến hành mỗi công thức 20 bình nuôi trồng, 3 lần lặp lại. Đánh giá kết quả dựa trên thời gian thu hoạch và năng suất thể quả nấm thu được.

– Nghiên cứu sấy khô thể quả

Sấy khô thể quả được thực hiện bằng 3 công thức: Công thức 1: sấy khô ở 40⁰C và Công thức 2: sấy khô ở nhiệt độ thấp có quạt gió với các thang nhiệt độ khác nhau: 40⁰C, 35⁰C và 30⁰C và công thức 3: sấy khô ở nhiệt độ thấp bằng máy đông khô. Đánh giá chất lượng của thể quả thông qua màu sắc sản phẩm, độ ẩm tương đối và chất lượng thể quả ở từng công thức thí nghiệm. Xác định thời gian sấy sản phẩm đạt độ ẩm tương đối là 10-12%.

– Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể

Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi được tiến hành trên 5 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau:

Thí nghiệm được tiến hành với 10 bình thể tích 500 ml, cho 200 ml môi trường, 3 lần lặp; lắc với tốc độ 110 vòng/phút, nuôi cấy trong 10 ngày.  Thu hoạch hệ sợi tính trọng lượng tươi và khô của các công thức thí nghiệm.

– Xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất giống, công nghệ nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris và xây dựng mô hình nuôi trồng thể quả

Mô hình nuôi trồng thể quả được thực hiện từ khâu sản xuất giống, chuẩn bị nguyên vật liệu làm giá thể, nuôi cấy nấm trên giá thể nhân tao thu hoạch được thể quả thành thục, quy mô 2000 bình nuôi cấy. Sản phẩm thu được là thể quả nấm C. militaris.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Khảo sát thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam và giám định mẫu thu được

3.1.1. Khảo sát thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

Kết quả giám định bước đầu cho thấy thành phần các loài nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam khá phong phú gồm 37 loài nấm thuộc 9 chi nấm: Achersonia, Akanthomyces, Beauveria, Cordyceps, Gibellula, Hymenostilbe, Isaria, Metarrhizium, Paecilomyces và Torrubiella.

Đối với nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris thu được 8 mẫu nấm đó là các các mẫu: HL1, HL2, HL22, HL31, HL34, HL35, BV9 và SL14. Các mẫu nấm này chủ yếu phân bố ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai, 6 mẫu (HL1, HL2, HL22, HL31, HL34, HL35), 1 mẫu vườn quốc gia Ba Vì (BV9) và 1 mẫu ở khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Sơn La (SL14).

3.1.2. Mô tả các mẫu nấm Đông trùng hạ thảo thu được

Mô tả và xây dựng được bộ mẫu gồm 243 mẫu nấm Đông trùng hạ thảo thu được ở Việt Nam, trong đó có 8 mẫu nấm được xác định là Cordyceps militaris

3.2. Xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo

3.2.1. Phân lập thuần khiết nấm từ thể quả thu được ở Việt Nam

Phân lập thuần khiết được 108 chủng nấm thuộc các loài nấm Cordyceps spp. và 8 chủng nấm thuộc Cordyceps militaris (HL1, HL2, HL22, HL31, HL34, HL35, SL14, BV9)

3.2.2. Sưu tập các chủng giống Đông trùng hạ thảo từ Trung Quốc và Nhật Bản

Sưu tập được 4 chủng giống Đông trùng hạ thảo: 1 chủng từ Trung Quốc (CM); 3 chủng từ Nhật Bản (F1010, F1012, F1080).

3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

Môi trường dinh dưỡng tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi là: PDA + 10% nhộng tằm. Nhiệt độ không khí thích hợp cho hệ sợi nấm sinh trưởng và phát triển từ 15⁰C-25⁰C. Độ ẩm không khí từ 80% – 85% thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi. pH môi trường từ 4,5 – 6,5 thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi.

3.2.4. Nghiên cứu bảo quản giống gốc

Phương pháp lưu trữ và bảo quản giống nấm Cordyceps militaris trong nước cất vô trùng băng kín ở 5^oC bảo đảm an toàn chất lượng sinh trưởng của nấm ít nhất trong thời gian 17 tháng.

3.3. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm Đông trùng hạ thảo phân lập được từ Việt Nam và sưu tập từ Trung Quốc và Nhật Bản có tiềm năng dược liệu

Các chủng CM, HL2, HL22, HL34, HL35, F1080 có khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis và kháng nấm Fusarium oxysporum. 3 chủng kháng tốt nhất là CM, HL2 và F1080.

3.4. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo trên giá thể nhân tạo

3.4.1. Nghiên cứu tạo giống sản xuất từ giống gốc

Môi trường nhân giống sản xuất từ giống gốc tốt nhất là: PDA + 10% nhộng tằm

3.4.2. Nghiên cứu xác định thành phần giá thể nhân tạo nuôi trồng thể quả

Thành phần giá thể nhân tạo nuôi trồng thể quả cho năng suất cao nhất là: Công thức, cơm + 2% nhộng tằm tươi.

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH giá thể đến sinh trưởng của hệ sợi và sự hình thành thể quả

pH giá thể từ 6,5-8 thích hợp cho sự sinh trưởng của mầm thể quả.

3.4.4. Nghiên cứu xác định các nhân tố sinh thái chính cho quá trình nuôi trồng thể quả

Kết quả nghiên cứu về nhiệt độ không khí ảnh hưởng đến sinh trưởng của mầm thể quả cho thấy với nhiệt độ 20⁰C – 25⁰C sinh trưởng của mầm thể quả đạt cao nhất

Ở độ ẩm không khí từ 85%-90% là kết quả nghiện cứu về độ ẩm của giá thể cho sinh trưởng tốt nhất

Với cường độ chiếu sáng 700 lux sinh trưởng của mầm thể quả là tốt nhất.

3.5. Tham quan học tập tại Nhật Bản

Đã tham quan, học tập tại Nhật Bản và học được phương pháp giám định các chủng nấm bằng kỹ thuật ADN.

4. KẾT LUẬN

4.1. Kết luận

Thu thập được 243 mẫu nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps và một số loài khác ở giai đoạn vô tính, trong đó có 8 mẫu nấm được xác định là Cordyceps militaris

Phân lập được 8 chủng nấm Cordyceps militaris và sưu tập được 4 chủng nấm từ nước ngoài: Cordyceps militaris CM từ Trung Quốc,  Cordyceps militaris F1080, Cordyceps militaris F1010 và Cordyceps militaris F1012 từ Nhật Bản

Chủng Cordyceps militaris CM, HL2 và chủng F1080 có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm sợi tốt nhất.

Môi trường sản xuất giống là môi trường Nhộng tằm, cơm + 2% nhộng tằm tươi, pH giá thể từ 6,5-8, nhiệt độ nuôi cấy 20-25 độ C, ẩm độ không khí 85-90%, cường độ ánh sáng là 700Lux thích hợp cho sự sinh trưởng của mầm thể quả và thể quả phát triển.

4.2. Kiến nghị

Căn cứ Thông tư số 67/2010/TT-BNNPTNT ngày 17/11/2010 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về việc thay đổi đơn giá công lao động kỹ thuật. Năm 2011, đề tài kiến nghị được điều chỉnh và cân đối kinh phí giữa các khoản mục cho hợp lý để tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình và xây dựng mô hình nuôi trồng thể quả.

5. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

Pham Quang Thu, 2009. Điều tra phát hiện nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat. Phân bố ở khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 4, trang 91-94.

Tiếng anh

Bao, Z.D., Wu, Z.G., and Zheng, F. (1994). [Amelioration of aminoglycoside nephrotoxicity by Cordyceps Sinensis in old patients]. Chinese Journal of Integrated Medicine 14: 259,271-273.

Berne, R.M., 1980: The role of Adenosine in the regulation of coronary blood flow. Circ. Res. 47: 807-813, 1980.

Bok JW, Lermer L, Chilton J, Klingeman HG, Towers GH., (1999) Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis. Phytochemistry 1999 Aug;51(7):891-8.