ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, việc ứng dụng tiến bộ kỹ thuật về công nghệ tế bào thực vật trong công tác chọn giống cây rừng đã được thực hiện tại nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam nuôi cấy mô đã được phát triển từ những năm 70. Tuy nhiên, các ứng dụng về nuôi cấy mô trong lâm nghiệp còn nhiều hạn chế về kỹ thuật, quy mô, vốn đầu tư, dẫn đến giá thành cây con từ nuôi cấy mô cao hơn nhiều so với cây hom và cây hạt do đó diện tích rừng trồng từ cây mô chưa nhiều. Mặc dù vậy, cây mô với các ưu điểm vượt trội như: có thể sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất, cây giống sản xuất ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, có độ trẻ hóa cao và có bộ rễ giống như cây con từ hạt nên có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn trên hiện trường. Nên trong thời gian tới cây con sản xuất từ nuôi cấy mô sẽ có vị trí xứng đáng trong sản xuất lâm nghiệp.

Trong các nghiên cứu về chọn giống cây rừng, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng đã chọn tạo được một số giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, bạch đàn lai và một số xuất xứ lát hoa có năng suất cao (Lê Đình Khả và cộng sự , 2003, Hà Huy Thịnh và cộng sự 2006). Các giống Keo lai và bạch đàn lai đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật bởi khả năng sinh trưởng tốt trên nhiều dạng lập địa. Việc phát triển nhanh các giống này vào trong sản xuất lâm nghiệp là một việc làm có ý nghĩa, ngoài việc nâng cao năng suất rừng trồng nó còn làm tăng tính an toàn sinh học trong trồng rừng vô tính. Để làm được công tác phát triển giống này, hoàn thiện công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô với hệ số nhân giống cao, thời gian nhân giống được rút ngắn và hạ giá thành sản xuất cây con là việc làm hết sức có ý nghĩa.

II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nhân nhanh một số giống cây lâm nghiệp mới chọn tạo bằng công nghệ tế bào

III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III.1. Đối tượng nghiên cứu

+ Keo lai tự nhiên: giống BV71, BV73, BV75.

+ Keo lai nhân tạo giống AM2

+ Bạch đàn lai nhân tạo giống UE35

+ Lát hoa (Nghệ An và Thái Lan)

III.2. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu dùng trong nuôi cấy là chồi lấy từ cây vật liệu gốc 1 năm tuổi tại vườn ươm của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng của các giống cây lâm nghiệp mới chọn lọc

III.3. Phương pháp nghiên cứu

III.3.1. Khử trùng mẫu vật

Quá trình khử trùng được tiến hành theo phương pháp khử trùng cho một số loài cây rừng (Đoàn Thị Mai và cộng sự 2000, 2003, 2005, 2009a và 2009b).

III.3.2. Môi trường nuôi cấy

Là môi trường Murashige & Skoog (MS) đối với keo lai và bạch đàn lai, và WPM (wooden plant medium) (kí hiệu WPM) đối với lát hoa, các môi trường được bổ sung một số chất điều hòa sinh trưởng thuộc hai nhóm Auxin, Cytokinin, chất phụ gia, các vitamin, đường. Được điều chỉnh PH = 5,8, thời gian hấp khử trùng 20 phút (1.2 atm tại 121⁰C)

III.3.3. Điều kiện nuôi cấy

+ Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ngày.

+ Cường độ ánh sáng khoảng 2000-3000 Lux.

+ Nhiệt độ phòng nuôi 25 – 27^oC đối với Keo, 27- 29⁰C cho Bạch đàn

III.3.4. Xử lý số liệu

Các thí nghiệm đều được bố trí nhiều lần lặp và xử lý kết quả theo phương pháp thống kê thông thường trên máy tính bằng phần mềm EXCEL.

IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

IV.1. Khử trùng

Để xác định phương pháp khử trùng tốt nhất cho từng đối tượng nghiên cứu, hai loại hóa chất thông dụng thường được dùng trong nuôi cấy mô là HgCl₂ và canxihypoclorit (Ca(OCl)₂) đã được thử nghiệm với các loại nồng độ (0,1%, 0,05% với HgCl₂, 5% và 10% với Ca(OCl)₂ và khoảng thời gian khử trùng khác nhau (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 phút). Kết quả điều kiện khử trùng thích hợp nhất cho từng loại cây được tổng hợp trong bảng 1 sau đây.

Bảng 1. Kết quả điều kiện khử trùng thích hợp nhất cho các cây thí nghiệm.

Đối tượng nghiên cứu	Hóa chất khử trùng	Thời gian khử trùng (phút)	Tỷ lệ bật chồi (%)	Sai dị (Sd)
Keo lai (BV71, BV73, BV75, AM2)	HgCl₂ 0,5%	8 – 10	12,6 – 15,6	1,3-2,2
Lát hoa (Lát Nghệ An, Lát Thái Lan)	HgCl2 0,1%	14	20,4	1,45
Bạch đàn (UE35, PN3D)	HgCl2 0,1%	10 – 12	15,6	2,3

Với bạch đàn lai Uro, phương pháp khử trùng thích hợp là sử dụng dung dịch HgCl₂ với nồng độ 0,1% và mẫu vật được khử trùng trong thời gian 12 phút cho kết quả khử trùng cao nhất. Khi áp dụng phương pháp này, tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình mẫu là 50,2% trong khi tỷ lệ mẫu bật chồi đạt tới 17,5%.

Kết quả thí nghiệm cho thấy đối với Lát hoa khử trùng bằng HgCl₂0,1% trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất, với tỷ lệ mẫu sạch đạt 60,37% và tỷ lệ mẫu bật chồi cao đạt 20,37%.

Với các dòng keo lai nghiên cứu, việc sử dụng HgCl₂ trong khoảng thời gian từ 8 đến 10 phút là thích hợp nhất. Mẫu vật được khử trùng theo phương pháp này có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (chỉ từ 58,52 đến 72,59%) và tỷ lệ bật chồi khá cao (đạt từ 8,15 đến 11,11%).

IV.2. Nhân chồi

IV.2.1. Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản

Các thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các đối tượng nghiên cứu được tiến hành trên 5 loại môi trường: Gamborg (B5), McCown Woody plant (WPM), Murashige & Skoog (MS), Schenk & Hildebrandt (SH) và Litvay (L), với 3 lần lặp, mối lần thí nghiệm được tiến hành với 3 bình nuôi cấy, mỗi bình thí nghiệm 15 mẫu.

Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường cơ bản thích hợp cho các thí nghiệm nuôi cấy mô đối với keo lai tự nhiên (BV71, BV73, BV75), keo lai nhân tạo (MA2) và Bạch đàn (UE35, PN3D) là môi trường MS. Riêng với cấc đối tượng lát hoa nghiên cứu, môi trường cơ bản thích hợp cho các thí nghiệm nuôi cấy mô là môi trường WPM.

IV.2.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân chồi của các đối tượng nghiên cứu

Sau khoảng 10- 15 ngày cấy các chồi bất định xuất hiện, khi chiều cao chồi đạt 1,5 – 2 cm chồi được cấy tách ra. Chồi được cấy vào môi trường MS cải tiến (kí hiệu là MS*) có bổ sung BAP hoặc Kinetin ở các nồng độ khác nhau từ 1,0 mg/l đến 2,0 mg/l.

Kết quả thí nghiệm thu được cho thấy:

– Đối với Keo lai: kết quả thí nghiệm cho thấy, BAP có tác dụng rõ lên quá trình tạo chồi của các dòng Keo lai thí nghiệm so với công thức đối chứng hay khi sử dụng chất kích thích sinh trưởng là Kn ở cùng nồng độ. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, khi bổ sung BAP với nồng độ 1,5mg/l vào môi trường nuôi cấy, số lượng chồi thu được sau quá trình kích thích tạo chồi đạt từ 7,5 đến 8,2 chồi/cụm tuỳ thuộc vào các dòng thí nghiệm. Khi sử dụng công thức nhân chồi này, các chồi tạo được cũng có chiều cao trung bình cao hơn so với các công thức còn lại. Môi trường được bổ sung BAP với nồng độ 2,0mg/l cũng cho hệ số nhân chồi tương đối cao (đạt từ 7,6 đến 7,7 chồi/cụm) tuy nhiên chiều cao chồi thu được chỉ đạt trung bình từ 4,1 đến 4,3 cm (chỉ số này đạt 4,4 đến 4,6cm khi sử dụng BAP nồng độ 1,5mg/l).

– Đối với hai đối tượng bạch đàn nghiên cứu, môi trường thích hợp cho quá trình nhân chồi là môi trường MS* (môi trường MS đã được thay đổi về thành phần và nồng độ các chất khoáng, vi tamin) có bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l. Khi được nuôi cấy trong môi trường này, các dòng Bạch đàn nuôi cấy cho hệ số nhân chồi đạt từ 6,8 đến 7,5 với chiều cao chồi trung bình đạt từ 2,4 đến 2,5 cm.

– Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nhân chồi cho Lát hoa cho thấy, cũng tương tự như với số đối tượng cây rừng khác, BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình tạo chồi cuả các mẫu vật nuôi cấy, khả năng kích thích tạo chồi của BAP là cao hơn hẳn Kn khi sử dụng cùng nồng độ trong môi trường nhân chồi. Với cả 2 đối tượng Lát hoa nghiên cứu, môi trường nhân chồi thích hợp là môi trường có thành phần khoáng cơ bản là môi trường WPM đã được cái tiến bằng việc thay đổi nồng độ các chất khoáng đa lượng, vi lượng và một số vitamin và axit amin (kí hiệu WPM*) có bổ sung BAP nồng độ 0,75mg/l.

IV.3. Ra rễ

Tạo rễ và huấn luyện là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để có được cây con hoàn chỉnh hoặc có thể cho ra rễ trực tiếp trên nền cát trong nhà kính. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất lượng nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ nhằm xác định môi trường thích hợp để tạo cây con hoàn chỉnh.

Khi chồi đạt chiều cao 3 – 4cm đối với Keo lai tự nhiên, 2,7 – 3cm đối với Bạch đàn và lát hoa có thể cắt để cấy chuyển sang môi trường hình thành rễ là môi trường 1/2MS^* có bổ xung IBA (Axit β – indol butyric), NAA (Axit α – naphtylacetic). Kết quả tổng hợp được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2. Tổng hợp kết quả thí nghiệm ra rễ trong phòng thí nghiệm cho các đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu	Môi trường	Tỷ lệ ra rễ (%) (Tb ± Sd)	Số rễ trung bình (cái)	Chiều dài rễ (cm)
Keo lai tự nhiên	1/2MS^* + IBA 1,5 mg/l	89,5 ± 4,6	4,5 ± 1,4	3,8 ± 1,1
Keo lai nhân tạo	1/2MS^* + IBA 1,0 mg/l	76,3 ± 5,2	5,8 ± 2,5	4,3 ± 2,3
Lát hoa	1/2MS^* + IBA 1,0 mg/l	93,3 ± 4,8	4,7 ± 2,62	5,8 ± 2,4
Bạch đàn	1/2MS^* + IBA 1,5 mg/l + 0,1 ABT mg/l	82,2 ± 6,4	1,3 ± 0,8	2,9 ± 0,8

Kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trường 1/2MS* được bổ sung 1,5mg/l IBA là thích hợp nhất cho quá trình tạo rễ nhân tạo của các dòng Keo lai BV71 và BV73. Với dòng BV75 tỷ lệ ra rễ đạt 92,45% khi sử dụng môi trường 1/2MS* có bổ sung IBA với nồng độ 2,0mg/l, tuy nhiên nếu sử dụng môi trường có bổ sung IBA với nồng độ 1,5mg/l cũng cho tỷ lệ ra rễ khá cao, đạt tới 91,06%. Mặt khác, khi sử dụng IBA với nồng độ cao, mặc dù chỉ tiêu số rễ trung bình/chồi đạt cao hơn so với khi sử dụng chất kích thích tạo rễ ở nồng độ thấp hơn nhưng chiều dài rễ trùng bình và chất lượng rễ thu được lại thấp hơn. Do đó, có thể kết luận với các dòng Keo lai thí nghiệm môi trường tạo rễ thích hợp là môi trường 1/2MS* + IBA với nồng độ 1,5mg/l.

Đối với hai dòng Lát hoa nghiên cứu IBA có tác dụng mạnh mẽ đến quá trình tạo rễ. Tỷ lệ ra rễ của cả hai dòng Lát hoa khi có bổ sung của IBA đạt khá cao 59,31% – 93,33%, trong khi đó sử dụng NAA để kích thích tạo rễ thì tỷ lệ này chỉ đạt từ 48,15% – 66,67%.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với Bạch đàn, kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho thấy: IBA có tác dụng mạnh mẽ đến quá trình tạo rễ, tỷ lệ ra rễ của bạch đàn khi được kích thích tạo rễ bằng môi trường 1/2MS^* + IBA 1,5 mg/l + 0,1 ABT mg/l các phụ gia khác tỷ lệ đạt từ 72% – 80%

Như vậy phương pháp ra rễ trong lọ cho tỷ lệ ra rễ tương đối cao đối với hầu hết các đối tượng. Riêng đối với Lát hoa thì tỷ lệ ra rễ bằng phương pháp này tương đối thấp và đòi hỏi thời gian ra rễ kéo dài.

IV.4. Ra rễ bằng phương pháp chấm thuốc bột thương phẩm (TTG1- gốc là IBA)

Với Lát hoa và Keo lai, đề tài đã tiến hành thử nghiệm cải tiến phương pháp ra rễ trực tiếp cho các đối tượng này bước đầu cho kết quả tốt. Các chồi thu được sau quá trình nhân có đủ tiêu chuẩn được xử lý chấm thuốc bột TTG1, cấy vào bầu đất hoặc luống cát tại vườn ươm, được chăm sóc như phương pháp giâm hom thông thường, phương pháp này có ưu điểm là không cần tiến hành ra rễ trong phòng thí nghiệm nên rút ngắn được thời gian nhân giống và tiết kiệm vật tư, nhân công, vì vậy đã giảm giá thành sản xuất cây con cũng như tạo được số lượng cây lớn (Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2009a và 2009b)

Bảng 3. Kết quả ra rễ bằng phương pháp chấm thuốc bột (TTG)

Đối tượng nghiên cứu	Thuốc kích thích ra rễ (TTG1)	Tû lÖ ra rÔ (%)	Số rÔ trung b×nh
Keo lai tự nhiên (BV71, BV73, BV75)	1 %	75- 86	4 – 6
Keo lai nhân tạo (MA2)	0,75 %	66 – 80	3 – 5
Lát hoa (Lát Nghệ An, lát hoa Thái Lan)	1,5 %	70 – 75	3 – 5

KẾT LUẬN

Đối với Keo lai tự nhiên

1. Phương pháp khử trùng thích hợp cho các dòng Keo lai tự nhiên mới được chọn tạo (BV71, BV73, BV75) là HgCl₂ với nồng độ 0,1% và thời gian khử trùng thích hợp là 8-10 phút.

3. Môi trường nhân chồi thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên cứu là môi trường MS1* có bổ sung IBA nồng độ 1,5mg/l.

4. Môi trường tiền ra rễ hay môi trường nâng cao chất lượng chồi cho các dòng Keo lai thí nghiệm là môi trường MS1* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,5mg/l.

5. Môi trường tạo rễ thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên cứu là 1/2MS1* có bổ sung IBA nồng độ 1,5mg/l.

6. Các chồi ra rễ được chăm sóc và huấn luyện theo các kết quả nghiên cứu về nhân giống Keo lai trước đây cho tỷ lệ sống cao trên 90%, cây con có sinh trưởng tốt, khoẻ mạnh.

7. Trong các dòng Keo lai thí nghiệm, dòng BV73 là dòng có khả năng nhân chồi cao hơn so với dòng BV71 và BV75.

Với Keo lai nhân tạo

1. Công thức khử trùng thích hợp cho dòng Keo lai nhân tạo là HgCl₂ với nồng độ 0,1% và thời gian khử trùng 10 -12 phút. Theo cách này, thu được 48,15% mẫu sạch và 19% số mẫu có chồi

3. Môi trường nhân chồi thích hợp cho dòng Keo lai nghiên cứu là MS* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l.

4. Môi trường tiền ra rễ hay môi trường nâng cao chất lượng chồi cho các dòng nghiên cứu là môi trường MS2* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l kết hợp với nồng độ NAA nồng độ 0,5mg/l.

5. Môi trường tạo rễ thích hợp cho các dòng Keo lai nhân tạo nghiên cứu là ½ MS2* bổ sung IBA nồng độ IBA 1,5mg/l.

6. Các chồi ra rễ được chăm sóc theo các kết quả về nghiên cứu về nhân giống Keo lai nhân tạo trước đây cho tỷ lệ sống cao trên 85% cây con sinh trưởng tốt, khoẻ mạnh.

Với Bạch đàn lai nhân tạo

1. Chất khử trùng mẫu tốt nhất là HgCl₂ nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng là 10 phút.

2. Mùa vụ thích hợp và cho tỷ lệ nẩy chồi cao nhất là tháng 4-9 với tỷ lệ mẫu nẩy chồi lần lượt là 15,76% và 16,05% sau 27 ngày nuôi cấy.

4. Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp là: MS3^* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l đường Sucrose + 5g/l agar, pH=5,8.

5. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh ra rễ là 1/2MS3^* + 2,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l ABT1 + 15 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH = 5,8.

6. Thời gian huấn luyện cây con tốt trước khi cấy ở vườn ươm là 8 – 16 ngày.

Đối với Bạch đàn uro

1. Phương pháp khử trùng mẫu tốt nhất là HgCl₂ nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng 8-10 phút.

2. Môi trường tạo chồi thích hợp là môi trường MS4* có bổ sung thêm BAP với nồng độ 0,5mg/l, thời gian cấy chuyển thích hợp là 10 – 12 ngày/ lần.

3. Môi trường tạo rễ phù hợp là môi trường 1/2MS4* có bổ sung IBA nồng độ 1,5mg/ lít.

Đối với Lát hoa

1. Đã xác định được kỹ thuật khử trùng tạo mẫu sạch thích hợp cho hai dòng Lát hoa (NA3 và TL3): Sử dụng chất HgCl₂ nồng độ 1% khử trùng trong 15 phút với tỷ lệ mẫu sạch là 60,37%

2. Môi trường nhân chồi thích hợp cho Lát hoa (NA3 và TL3) là WPM^* + 1,0mg/l BAP với tỷ lệ 6,45 – 6,48 chồi/cụm sau 20 ngày.

3. Môi trường tạo rễ Invitro thích hợp là WPM^*+ 1,0mg/l IBA có tỷ lệ đạt chồi ra rễ đạt 93,33% (NA3) và 89,63% (TL3) sau 20-30 ngày cấy.

Đã xác định được phương pháp ra rễ chồi Invitro bằng thuốc bột TTG cho Keo lai và Lát hoa

– Với keo lai, cho ra rễ chồi non Invitro bằng thuốc bột TTG nồng độ 1,5%, trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 6 và từ tháng 9 đến tháng 11 là thích hợp.

– Khi sử dụng phương pháp này, tỷ lệ ra rễ cho Keo lai đạt đến trên 95%, đặc biệt thời gian cho quá trình ra rễ và huấn luyện cây rút ngắn được từ 10-15 ngày (30 ngày so với 40-45 ngày so với phương pháp ra rễ trong lọ).

– Đối với Lát hoa, cho ra rễ chồi non Invitro bằng thuốc bột TTG nồng độ 1,0%, trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 3 và từ tháng 7 đến tháng 10 là thích hợp, thời gian ra rễ vào mùa xuân –hè là 15-20 ngày còn thu-đông là 20-30 ngày

– Khi sử dụng phương pháp này, tỷ lệ ra rễ đạt đến trên 93%, đặc biệt thời gian cho quá trình ra rễ và huấn luyện cây chỉ là 25-30 ngày, rút ngắn được từ 15-20 ngày (so với 40-45 ngày so với phương pháp ra rễ trong lọ).