Báo cáo kết quả đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gene để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm

Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường ; Lê Thị Huyền Thanh;

Phan Thị Mỵ Lan ; Đỗ Tiến Phát , Đinh Thị Phòng cùng các cộng tác viên khác.

. MỞ ĐẦU:

Thông nhựa, còn gọi là thông ta hay thông hai lá, có tên khoa học là Pinus merkusii Jungh & Vriese. Thông nhựa là loài thông nhịêt đới, thuộc chi Pinus, họ Pinaceae., có khả năng sinh trưởng và phát triển trên những lập địa nghèo dinh dưỡng, đất bị thoái hoá. Ở nước ta, thông nhựa được chọn là cây trồng chính trên một số vùng đất đồi nghèo kiệt của Hà Tây, Quảng ninh, Phú thọ, Thanh hoá, Nghệ an, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế và một số vùng ở Tây nguyên. Thông nhựa được trồng với mục đích chính là khai thác nhựa. Nhựa thông được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp sản xuất sơn, hoá chất tẩy, rửa v.v..Ngoài ra, gỗ thông nhựa do có vân đẹp nên cũng được sử dụng để đóng đồ thủ công mỹ nghệ, đồ mộc, trong xây dựng và công nghiệp giấy. Ngoài ra, do khả năng sống được trên những vùng đồi trọc, nghèo dinh dưỡng, thông nhựa còn được xem là cây giúp cải thiện môi trường, che phủ đất tốt.

Lượng nhựa thông sản xuất trong cả nước năm 2000 là 10.000tấn. Thông nhựa đã trở thành cây xoá đói, giảm nghèo cho nhiều địa phương vùng đồi núi khó khăn. Tuy nhiên, trong mấy năm gần đây, nhiều rừng thông nhựa đã bị sâu bệnh hại tàn phá, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng. Một trong những loài sâu hại được các vùng trồng thông nhựa kêu cứu trong những năm gân đây là sâu róm (Dendrolimus punctatus Walker). Sâu róm đi thành đàn và đã ăn trụi lá thông, làm giảm sinh trưởng, phát triển của cây, đặc biệt là giảm năng suất nhựa thông. Theo thống kê của công ty sản xuất kinh doanh thông Hà Tĩnh, lượng nhựa của công ty thu được năm 2000 là 1.350 tấn, tuy nhiên, năm 2001, do bị sâu róm phá hại, lượng nhựa chỉ còn đạt 680 tấn. Hàng chục ngàn hecta thông nhựa của các địa phương khác cũng bị sâu róm tàn phá, gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất. Từ những thực tế đó đã đặt ra một vấn đề bức xúc cho những người làm giống cây lâm nghiệp là cần phải chọn tạo được những giống thông có khả năng chống chịu cao với sâu bệnh hại nói chung và sâu róm nói riêng để hạn chế thiệt hại cho sản xuất, đặc biệt là giảm bớt khó khăn cho những vùng trồng thông vốn đã khó khăn.

Việc chọn tạo và cải thiện giống thông đã và đang được triển khai tại một số cơ quan nghiên cứu lâm nghiệp như các công ty giống lâm nghiệp, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng (Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam), các trường đại học Lâm nghiệp v.v…. Những nghiên cứu này đã chú trọng đến việc tạo giống cây rừng có khả năng chống chịu sâu bệnh, trong đó có các giống thông. Tuy nhiên, do đặc điểm sinh trưởng dài ngày của cây rừng nên cho đến nay vẫn chưa có giống thông nhựa nào chống chịu được với sâu róm được đưa vào sản xuất. Quá trình lai tạo theo phương pháp truyền thống này yêu cầu nhiều thời gian và công sức.

Những tiến bộ gần đây của công nghệ sinh học, trong đó kỹ thuật chuyển gene đã và đang mở ra một tiềm năng to lớn trong cải thiện giống cây trồng nông nghiệp. Ứng dụng công nghệ này, nhiều nước trên thế giới đã tạo ra được những giống cây trồng mang những tính trạng được cải thiện, như cải thiện năng suất, cải thiện chất lượng, cải thiện tích chống chịu với những điều kiện sống bất lợi v.v.. Kết quả là đã góp phần gia tăng sản lượng nông nghiệp, hạn chế ô nhiễm môi trường, và rút ngắn thời gian tạo giống một cách đáng kể. Những ứng dụng này đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với cây lâm nghiệp-loài cây có thời gian sinh trưởng dài.

Xuất phát từ những thực tế đó đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gene để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm” được cho phép thực hiện.

II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

(i) Làm chủ được kỹ thuật tái sinh cây thông nhựa trong điều kiện invitro trực tiếp qua nuôi cấy hạt trưởng thành, đoạn thân, mẩu lá hoặc gián tiếp thông qua mô sẹo/phôi, phục vụ chuyển gene .

(ii) Xác định được các thông số kỹ thuật chuyển gene (chuyển các gene chỉ thị như gus, gene kháng thuốc kháng sinh (Kanamycine/Hygromycine) bằng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương tiện bắn gene phục vụ chuyển gene mục tiêu Bt (cry 1Ab)..

(iii)Tạo cây thông nhựa kháng sâu róm bằng chuyển gene Bt (cryIAb/ Ac)

III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1. Nội dung nghiên cứu : gồm 3 nội dung chính:

(i). Nghiên cứu kỹ thuật tạo cây thông nhựa invitro bằng nuôi cấy một số loại vật liệu khác nhau trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo :

(a)Tạo cây thông nhựa invitro bằng cách tái sinh trực tiếp từ hạt, chồi ngọn, đoạn thân, mảnh lá.

(b)Tạo cây thông nhựa bằng cách tái sinh gián tiếp: thông qua mô sẹo/ phôi soma từ mẫu vật khác nhau.

(ii). Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gene và kiểm tra kết quả chuyển gene:

(a) Nghiên cứu các thông số kỹ thuật chuyển gene vào thông nhựa.

*Phương tiện chuyển gene : Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciences và phương tiện bắn gene..

*Các gene nghiên cứu: gene chỉ thị uidA (gus), gene chọn lọc: kháng thuốc kháng sinh kanamycin; gene mục tiêu: nhóm gene Bt (cry1Ab/cry1Ac).

(b) Kiểm tra hiện diện chuyển gene bằng cách nhuộm với hóa chất, phản ứng PCR và lai southern.

(iii). Đánh giá cây thông nhựa mang gene kháng sâu róm trong nhà lưới/ nhà kính về:

(a) Tỷ lệ sống (%).

(b) Mức độ phản ứng với sâu róm.(tỷ lệ %).

(c) Đặc điểm hình thái cây chuyển gene.

(d) Số lượng gene.

2. Phương pháp nghiên cứu:

(i) Nghiên cứukỹ thuật tạo cây thông nhựa invitro bằng nuôi cấy một số loại vật liệu khác nhau trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo:

– Phương pháp nuôi cấy invitro được áp dụng xuyên suốt đề tài; trong đó vật lịệu thí nghiệm là phôi non, phôi trưởng thành, đoạn thân, mảnh lá v.v. được vô trùng bằng các loại hoá chất vô trùng như HgCl₂, NaOCl, Cồn 70, nước oxy già, rồi tráng bằng nước cất vô trùng 4-5 lần trước khi cấy nguyên liệu vào môi truờng dinh dưỡng (các môi trường sử dụng được ghi cụ thể ở từng thí nghiệm) và nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25⁰C ±1⁰C với 16g sáng và 8 giờ tối hay tối hoàn toàn tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm. pH môi trường nuôi cấy: 5,5. Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên và phân tích bằng phần mềm SPSS 16.1

(ii). Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gene và kiểm tra kết quả chuyển gene:

-Kỹ thuật chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương tiện bắn gene được sử dụng. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens như nồng độ vi khuẩn, ngưỡng kháng sinh, thời gian lây nhiễm, nồng độ acetosyringone, loại mẫu vật, kỹ thuật chọn lọc v.v…được nghiên cứu kỹ .

-Kiểm tra hiện diện gene chuyển: Việc xác định thể hiện gene thông qua kỹ thuật nhuộm với X-gluc; tách chiết AND để chạy phản ứng PCR với các mồi tương ứng các gene sử dụng (uidA, nptII, cry 1Ab). Sự xuất hiện các band, vạch đặc trưng sẽ củng cố khả năng vật liệu đã được biến nạp gene mục tiêu. Lai Southern nhằm củng cố hiện diện của gene trên mạch ADN. Những mẫu thể hiện gene sẽ được tiếp tục nhân và tái sinh cây xanh. Qua các phản ứng PCR với mồi tương ứng gene uidA, nptII và cry 1Ab sẽ xác định được số gene đã được tiếp nhận

(iii). Đánh giá cây thông nhựa mang gene kháng sâu róm trong nhà lưới/ nhà kính:

-Áp dụng thử nghiệm sinh học: thu thập và nuôi sâu róm trong nhà lưới. Lây nhiễm cây biến nạp gene với sâu non tuổi 2-3. Cây không biến nạp được sử dụng làm cây đối chứng. Tỷ lệ gây hại và hình thái cây được ghi nhận.

3. Vật liệu nghiên cứu:

–Hạt của 6 gia đình thông nhựa (2, 6, 29, 31, 44 và 54), đã được Trung tâm giống cây rừng (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) chọn ra từ tập đoàn giống thông nhựa của Viện và xác định là dòng trội có năng suất nhựa cao, sinh trưởng tốt và bị sâu róm gây hại ở một số tỉnh, được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm.

-Hoá chất: Là các hoá chất đạt tiêu chuẩn quốc tế, có nguồn gốc từ các nhà sản xuất như Sigma, Merck, Fermentas, Duchefa, Wako có uy tín lớn trên thế giới về sản xuất hóa chất cho nghiên cứu sinh học phân tử.

-Các vectors cần thiết cho chuyển gene: Phân Viện đã nhận được gene cry 1Ab và uidA được chứa trong plasmid pCAMBIA 2301-UBI-Bt từ GS. Altosaar, trường đại học Ottawa,Canada.

-Dụng cụ, phương tiện: đạt tiêu chuẩn đo lường, chất lượng quốc tế.: máy ly tâm lạnh (Đức), Tủ ấm (Đức), máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ (Nhật), Cân các loại, dụng cụ đo pH (Thuỵ sỹ), máy cất nước (Anh) v.v..

4. Phương pháp thí nghiệm & phân tích thống kê: Phần lớn các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, ít nhất 3 lần lặp lại. Kết quả được phân tích bằng phần mềm SPSS ver.16.1

IV. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC (2006 -2010).

1. Nội dung1:Nghiên cứu kỹ thuật tạo cây thông nhựa invitro bằng nuôi cấy một số loại vật liệu khác nhau trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo:

*Nghiên cứu kỹ thuật vô trùng và hoá chất vô trùng.

Kết quả nghiên cứu vô trùng mẫu cấy, cho thấy rửa hạt dưới vòi nước máy 1-2 giờ rồi mới xử lý bằng cồn 70 trong 5 phút . Sau đó xử lý bằng nước Javen 60% trong 15 phút, tráng bằng nước cất 4 lần đã đưa tỷ lệ hạt nảy mầm không bị nhiễm lên 75-80% tuỳ theo dòng.

Quy trình này được sử dụng xuyên suốt các thí nghiệm sau.

* Nghiên cứu kỹ thuật tạo chồi chồi trực tiếp từ cấy phôi hạt trưởng thành.

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng một số môi trường nuôi cấy.

Kết quả các thí nghiệm thăm dò cho thấy khả năng tạo chồi của các loại mẫu như chồi ngọn rất thấp; trong khi các loại mẫu như mảnh lá, đoạn thân chưa thấy xuất hiện tiềm năng tạo chồi. Vì thế đề tài ưu tiên khảo sát khả năng tạo chồi từ phôi hạt trưởng thành trên một số môi trường dinh dưỡng cơ bản: MS (Murashige& Skoog.1962); DCR (Gupta& Durzan.1985) ; TE (Tang et al.2001) và MLV (Litvay et al.1985). Kết quả cho thấy ở 30 ngày sau cấy (NSC), trong số 4 loại môi trường dinh dưỡng được thử nghiệm, những mẫu được cấy trên môi trường MLV có tỷ lệ tạo chồi cao nhất (84,15%) so với đối chứng và so với các môi trường khác. Tuy nhiên, tiếp tục quan sát ở giai đoạn 60 NSC đã ghi nhận tỷ lệ tạo chồi ở môi trường TE cho tỷ lệ tạo chồi vượt lên (60,56%), trong khi ở môi trường MLV, tỷ lệ này chỉ là 53,8%. Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa về số chồi trung bình được tạo trên mẫu cấy, cũng như chiều cao chồi giữa hai loại môi trường này. Như vậy, qua thí nghiệm này, có thể thấy môi trường TE hay MLV có phản ứng tốt trong tạo chồi/ cụm chồi thông nhựa.

b.Nghiên cứu tác động của nồng độ BA, NAA đến tạo chồi.

Năm nồng độ khác nhau của BA (0; 1; 2; 3; 4;và 5 mg/l) , có và không kết hợp NAA trong môi trường TE được nghiên cứu trong tạo chồi, cụm chồi thông nhựa..

Kết quả là, nồng độ BA (4mg/l) có tỷ lệ tạo chồi cao nhất (80%). Nếu nâng nồng độ BA lên 5,0m/l, tỷ lệ tạo chồi có xu hướng giảm (53,33%). Khi không bổ sung BA, tỷ lệ tạo chồi rất thấp (20%), nhưng số chồi trung bình chỉ đạt 6 chồi/ mẫu cấy. Số chồi này không tiếp tục phát triển ở những lần quan sát sau và lụi dần rồi chết. Khi kết hợp NAA (0,7mg/l) với BA(4,0mg/l) có khả năng kích thích tạo chồi cao nhất (66,67%).

Ngoài ra đề tài cũng tiến hành nghiên cứu tác động phối hợp BA và TDZ.Tuy nhiên kết quả nghiên cứu trên thông nhựa cho thấy TDZ không có ảnh hưởng đế kích thích tạo chồi một cách có ý nghĩa, thể hiện ở nghiệm thức đối chứng, không bổ sung TDZ chỉ có BA, phôi chín vẫn tạo chồi với tỷ lệ khá (66,67%). Bổ sung 0,1-0,5mg/l TDZ có làm tăng tỷ lệ tạo chồi lên 80%, nhưng không khác biệt có ý giữa các nghiệm thức thí nghiệm ngoại trừ đối chứng.

Sau khi tạo được chồi, việc làm tăng chiều cao chồi cũng hết sức quan trọng. Để cây con vươn chồi, 1,0mg/l GA₃ đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy và ghi nhận tác dụng kích thích chồi thông vươn tới 3,0cm sau 50 ngày xử lý.

Để tạo cây thông hoàn chỉnh, một số chất kích thích ra rễ (NAA&IBA) đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy và đã ghi nhận tỷ lệ ra cao nhất khi áp dụng 1,0mg/l NAA là 49,7% trong khi đó ở nồng độ 0,5 mg/l IBA, tỷ lệ ra rễ là 68,9%.

*Nghiên cứu tạo chồi invitro từ nuôi cấy phôi non thông nhựa tạo tế bào soma.

Một trong những loại nguyên liệu được xử dụng thành công trong chuyển gene vào thông là dạng tiền phôi soma. Tiền phôi soma có thể được tạo thành từ nuôi cấy phôi non trên môi trường dinh dưỡng. Sau khi tạo được phát sinh phôi, những phát sinh phôi này được nhân nhanh để cung cấp đủ nguyên liệu cho chuyển gene. Vì mục đích cuối cùng của chuyển gene là phải tạo được cây con mang gene chuyển. Như vậy, vật liệu phải tái sinh được thành cây con mang gene mục tiêu cho các phân tích khác. Vì thế cần phải xây dựng kỹ thuật tái sinh cây con từ nuôi cấy phôi non. Các bước tạo cây con từ nuôi cấy phôi non thông nhựa bao gồm: tạo phát sinh phôi; nhân nhanh tiền phôi; thành thục hóa tiền phôi và tạo phôi soma; cuối cùng là tái sinh cây xanh từ phôi soma.

Phôi non các gia đình thông nhựa được nuôi cấy trên môi trường MLV có bổ sung 4g/l phytagel, 500mg/l glutamine, 500mg/l cas aminoacid, sucrose; 20g/l, 2,-4 D (1-3mg/l), BA (1,0mg/l) và để trong tối ở 25⁰C. Các gia đình 31,44 và 54 có tỷ lệ tạo phát sinh từ 37,5-47,5%. Các gia đình số 2,6 và 29 có tỷ lệ tạo phát sinh từ 21,8-32,5%.

Khối phát sinh sau khi tạo ra được tách để nhân nhanh trên môi trường MLV có bổ sung BA(1,0mg/l), NAA(1-3mg/l) thay cho 2,4-D. Cấy chuyển được tiến hành 2 tuần/lần. Kết quả là trọng lượng sau 2 tuần nuôi cấy tăng từ 5-7 lần so với trọng lượng ban đầu với sự phối hợp của 1,0mg/l BA và 3,0mg/l NAA.

Sau khi thu được lượng lớn khối tiền phôi, những tiền phôi này được chuyển sang môi trường thành thục và tạo phôi soma. Môi trường MLV có bổ sung 60g/l Maltose thay cho sucrose; 10g/l phytagelvà 80mg/l ABA được sử dụng trong nuôi cấy tiền phôi tạo thành thục hóa và tạo phôi soma tốt nhất (24,3 phôi soma/150mg tiền phôi)

Các phôi soma ở giai đoạn lá mầm được chọn để nghiên cứu tái sinh cây xanh trên môi trường 1/2MS hay ½ TE có hay không có 0,5mg/l IBA hay 0,5mg/l NAA. Kết quả cho thấy 100% cây xanh được tái sinh. Các cây đều khỏe mạnh và đồng thời tạo rễ. Cây con đã được thuần hóa trước khi trồng trong nhà lưới.

Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gene và kiểm tra kết quả chuyển gene:

a. Nghiên cứu một số thông số trong chuyển gene uidA vào mẫu thông nhựa.

Một số thông số như ngưỡng gây chết của Kanamycine, , nồng độ timentin, nồng độ acetosyringone, ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian siêu âm đã được nghiên cứu phục vụ thí nghiệm chuyển gene.

Ngưỡng gây chết của kanamycin đã được nghiên cứu trên cả phôi trưởng thành và khối tiền phôi soma. Kết quả cho thấy 35-40mg/l kanamycin sẽ làm chết >90% số phôi trưởng thành và 35mg/l kanamycin sẽ gây chết >95% cho tế bào tiền phôi. Như vậy hai nồng độ này được sử dụng để thanh lọc, chọn vật liệu biến nạp gene. Tương tự, ngưỡng gây chết của kháng sinh Timentin (dùng diệt vi khuẩn dư sau biến nạp) cũng đã được khảo sát. Khi bổ sung 500mg/l Timentin vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tiền phôi hay phôi trưởng thành sau biến nạp, không ghi nhận tỷ lệ chết do thuốc gây nên. Nồng độ này sẽ được sử dụng trong loại vi khuẩn dư sau biến nạp.

Một số thông số khác như nồng độ acetosyringone, 50µM được quan sát là phù hợp cho kích hoạt vi khuẩn Agrobacterium trong lây nhiễm chuyển gene.

Một số nồng độ của chủng vi khuẩn agrobacterium (LBA 4404) chứa plasmid CAMBIA 2301-Ubi-BT đã được sử dụng để lây nhiễm phôi trưởng thành cũng như khối tiền phôi. Kết quả cho thấy ở nồng độ vi khuẩn thấp (OD₆₀₀=0,3) tỷ lệ phôi sống biến động từ 50,2 đến 66,8% tuỳ theo dòng. Trong khi tăng nồng độ vi khuẩn lên OD₆₀₀=0,4 hay 0,5, tỷ lệ phôi sống giảm xuống còn 35%. Tỷ lệ thể hiện GUS của các dòng tương đối thấp.

Thời gian lây nhiễm 60-90 phút và đồng nuôi cấy 24 giờ, trong tối được xem là phù hợp. Đối với phôi trưởng thành, việc gây xước nhẹ trên bề mặt phôi góp phần gia tăng tỷ lệ thể hiện gus. Tuy nhiên những vật liệu biến nạp gene chỉ sống được 7-10 ngày trên môi trường chọn lọc Kanamycin (35 mg) rồi chết.

b. Tiến hành chuyển gene vào mẫu thông (phôi trưởng thành và tiền phôi).

*Bằng phương tiện bắn gene: Trên cơ sở những thông số trên, việc chuyển gene mục tiêu bằng phương tiện bắn gene đã được thực hiện vào phôi trưởng thành và tiền phôi soma. Đã thu được vật liệu biến nạp gene. Tuy nhiên, phôi trưởng thành biến nạp chết sau 10 ngày trên môi trường chọn lọc. Tiền phôi biến nạp chết sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có 35mg/l kanamycin.

*Bằng vi khuẩn Agrobacterium:

Sử dụng nồng độ vi khuẩn trên, đề tài đã tiến hành chuyển gene cry 1Ab vào phôi trưởng thành và tiền phôi soma. Kết quả là đã thu được vật liệu biến nạp gene cho cả hai loại vật liệu. Tuy nhiên chỉ có tiền phôi hiện còn sống trên môi trường chọn lọc với 35mg/l kanamycin. Loại phôi trưởng thành biến nạp chết sau 12 ngày nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.

Sau khi chuyển nạp, mẫu của các vật liệu biến nạp đều được nhuộm với X-gluc để kiểm tra hiện diện gene uidA (gus). Kết quả là đã thu được vât liệu biến nạp gene và vật liệu hiện đang sống trên môi trường chọn lọc với 35mg/l kanamycin.

Nội dung 3: Đánh giá cây thông nhựa mang gene kháng sâu róm trong nhà lưới/ nhà kính: Nội dung này đang được triển khai, chưa có kết quả.

V. KẾT LUẬN.

Thông nhựa là loại cây thân gỗ thuộc chi thông. Chi thông được cho là chi khó thành công trong tái sinh invitro và chuyển gene. Đề tài được bắt đầu thực hiện từ tháng 11-2006. Qua quá trình nghiên cứu, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:

-Đã xây dựng được kỹ thuật tạo cây invitro hòan chỉnh từ nuôi cấy phôi trưởng thành với hệ số nhân chồi cao.

-Đã tạo được phôi soma và tái sinh cây xanh từ phôi soma thông nhựa trong invitro. Đặc biệt là tạo được nguồn vật liệu chủ động, dồi dào cho chuyển gene.

-Đã tiến hành nghiên cứu các thông số chuyển gene và thực hiện chuyển gene vào cả hai loại mẫu thông là phôi trưởng thành và tiền phôi soma và thu được thể hiện gene gus thông qua hai phương tiện : vi khuẩn và phương tiện bắn gene.

-Đã thu được vật liệu biến nạp gene của hai gia đình 31 và 54 chuyển bằng vi khuẩn vào tiền phôi soma đang sống trên môi trường chọn lọc kanamycin 35mg/l

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Gupta PK & Durzan DJ (1985): Shoot multiplication from mature leaves od Doughlas-fir

(Pseudotsuga menziesii) and sugar pine (Pinus lambertiana). Plant ell Report. 4:

177-180.

Litvay JD; Verma DC & Johnson MA (1985): Influence of Lobloly pine (Pinus taeda L.)

culture medium and its components on growth and somatic embryogenesis of the

wild carrot (Daucus carota L. ) Plant. Cell. Rrport. 4: 325-328.

Murashige T & Skoog F (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physio. Plant. 15: 473-497

Tang, W; Sederoff R and Whetten R (2001): Regeneration of transgenic loblloly

pine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with Agrobacterium

tumefaciens. Planta. 213 (6): 981-989.