Báo cáo tóm tắt đề tài: Nghiên cứu lai giống nhóm loài xoan để tạo giống mới có những đặc điểm ưu việt

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Meliaceae là họ xoan phần lớn là cây gỗ, lá thường kép 1 lần lông chim, ít khi lá đơn mọc cách, rất gần với họ Cam (Rutaceae) và có nhiều điểm chung với họ Thanh thất (Simaroubaceae ), nhưng hoa thường lưỡng tính, nhị thường hợp thành ống….

Chi Azadirachta có 2 loài là Azadirachta excelsa và Azadirachta indica còn chi Melia có 3 loài là Melia azadarach, Melia dubi và Melia toosendan.

Azadirachta excelsa là tên khoa học của cây Xoan chịu hạn Ninh Thuận tên địa phương là Cóc hành là loài cây đặc biệt trong kiểu rừng khộp khô hạn của vùng Ninh Thuận. Đó là loài cây đâm chồi nẩy lộc và có tán lá xanh đậm vào mùa khô, trong khi các loài khác luôn rụng lá vào mùa này. Đây là một loại cây đa mục đích, có giá trị kinh tế cao, với đặc tính ưa sáng, chu kỳ kinh doanh tương đối ngắn so loài cây bản địa khác, dễ gây trồng trên đất nghèo và nơi có khí hậu khô hạn. Nó được đánh giá là một trong những loại cây chủ lực phục vụ cho công tác trồng rừng ở vùng khô hạn tỉnh Ninh Thuận.

Melia azedarach Linn là tên khoa học của cây Xoan ta hay còn được gọi là Thầu đâu, Sầu đông, Sầu đâu, phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào và Campuchia. Ở Việt Nam Xoan ta mọc tự nhiên hoặc được trồng ở hầu khắp các tỉnh thành từ Bắc tới Nam, là loài cây ưa sáng, ưa khí hậu nóng – ẩm, chịu được rét, thích ứng với nhiều loại đất, từ chua đến kiềm. Là loài cây mọc rất nhanh, chiều cao có thể đến 20 m, đường kính khoảng 60 cm. Gỗ Xoan ta thuộc gỗ nhóm V, gỗ xoan có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ mềm có khối lượng 565 kg/m³, lực kéo ngang thớ 22 kg/cm2, nén dọc thớ 339 kg/cm². Gỗ Xoan ta sau khi ngâm khó bị mối mọt, nên gỗ Xoan ta thường dùng trong xây dựng, trang trí nội thất và điêu khắc…

Nghiên cứu chọn giống và lai giống giữa 2 loài Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) thuộc chi Azadirachta và loài Xoan ta (Melia azadarach) thuộc chi Melia nhằm phối kết hợp được những đặc tính ưu việt của bố mẹ vào con lai đã được thực hiện bởi đề tài “Nghiên cứu lai giống nhóm loài xoan để tạo giống mới có những đặc điểm ưu việt”.

II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Mục tiêu nghiên cứu:

Chọn tạo một số giống xoan lai, giống bố mẹ có sinh trưởng nhanh hình dáng thân đẹp

2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

a. Nội dung nghiên cứu

1. Chọn lọc các cây trội cho các loài xoan.

– Chọn lọc cây trội cho Xoan ta (Melia azadarach) và Cóc Hành (Azadirachta excelsa)

– Phân tích đa dạng di truyền của một số nguồn giống chọn lọc để lai giống.

2. Lai giống

– Xác định thời kỳ nở hoa, kết quả của một số loài xoan sử dụng cho lai giống.

– Nghiên cứu lai giống khác chi giữa Xoan ta (Melia azadarach) và Cóc Hành (Azadirachta excelsa)

3. Khảo nghiệm giống lai và các cây bố mẹ

– So sánh sinh trưởng của cây lai với giống sản xuất đại trà và bố mẹ.

4. Nghiên cứu nhân giống sinh dưỡng (ghép, hom) cho các giống lai mới

b. Phương pháp nghiên cứu

* Chọn lọc cây trội:

– Chọn lọc cây trội theo quy phạm xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN 15 – 93). quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống chuyển hoá (QPN 16- 93) .

* Nghiên cứu lai giống:

– Thu thập và bảo quản hạt phấn theo phương pháp của Moncur (1995).

– Lai giống (thụ phấn có kiểm soát) theo phương pháp của Moncur (1995)

* Phương pháp bố trí khảo nghiệm giống:

Bố trí khảo nghiệm và xử lý số liệu theo William và Matheson (1994).

* Phương pháp phân tích đa dạng di truyền theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

PHẦN I: CÁC NGHIÊN CỨU CƠ SỞ PHỤC VỤ CHO CHỌN GIỐNG VÀ LAI GIỐNG

A. CHỌN LỌC CÂY TRỘI VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1. Chọn lọc cây trội ( Xoan ta và Xoan chịu hạn Ninh thuận) làm cây bố mẹ

Theo tiêu chuẩn đánh giá phân cấp cây trội, đề tài đã chọn được 82 cây trội có hình dáng thân thẳng đẹp, tròn đều và chiều cao dưới cành đều đạt trên 5 m và 27 cây trội có chiều cao dưới 5m ở các tỉnh phía Bắc. Các cây trội này đều được thu hạt để tiến hành khảo nghiệm. Hạt các cây trội này đều có khối lượng biến động lớn từ 13,74g đến 59,74g trên 100 hạt. Tuy nhiên theo dõi sinh trưởng các cây này trong vườn ươm và ở hiện trường khảo nghiệm trong giai đoạn đầu cho thấy các cây có khối lượng 100 hạt lớn chưa phải đã cho sinh trưởng nhanh hơn các cây có khối lượng 100 hạt nhỏ.

Còn ở tỉnh Bình Định chọn được 57 cây trội thuộc 20 xã là Canh Vĩnh, Cát Bình, Cát Hiệp, Cát Minh, Nhơn hòa, Nhơn Lộc, Nhơn Thọ, An Tân, An Hòa, Tây Xuân, Tây Giang, Tây Bình, Bình Thành, Bình Hòa, Vĩnh Hiệp, Vĩnh Quang, Ân Đức, Ân Nghĩa, Ân Tường Tây, Ân Phong. Các cây trội chọn ở Bình Định có cấp kính tương đối đều hơn các cây trội chọn ở các tỉnh phía Bắc, tuy nhiên sinh trưởng ở vườn ươm ở những năm đầu sau khi trồng rừng cho thấy các cây trội này hầu như có sinh trưởng chậm hơn các cây trội chọn ở các tỉnh phía Bắc, màu sắc lá cũng kém xanh hơn ( lá của các cây chọn ở phía Bắc có màu xanh đậm hơn lá các cây chọn ở Bình Đình).

Các cây trội được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn Ninh Thuận, cây Xoan chịu hạn Ninh Thuận thường đi cùng với các loài cây như Căm xe, Cà Chí, Cẩm Liên, Dầu, Kiết mọt, Sắn ổi, Bằng Lăng, với thảm tươi là Cỏ lông chông, táo, Cỏ hôi, Lành ngạch, ở 2 loại đất là Feralit và đất xám ở 6 xã là Ma Nới, Hòa Sơn thuộc huyện Ninh Sơn và xã Phước Thắng, Phước Đại, Phước Chính, Phước Hòa thuộc huyện Bắc Ái tỉnh Ninh Thuận. Các cây trội được chọn đều có hình dáng thân đẹp và ra hoa kết quả tốt, tuy nhiên đường kính các cây trội được chọn không lớn thường dao động 14 – 40cm, các cây trội chọn ở huyện Ninh Sơn thường có cấp kính nhỏ hơn 20cm, còn các cây trội chọn huyện Bắc Ái số cây có cấp kính trên 25cm nhiều hơn. Các cây trội có đường kính lớn trên 40cm hầu như đã bị người dân khai thác. Chiều cao dưới cành của các cây trội được chọn cũng dao động từ 5,5 m – 10 m ( bảng 8 )

2. Một số đặc điểm về nở hoa, thụ phấn ở các loài xoan được nghiên cứu

2.1 Thời kỳ nở hoa của các loài xoan được dùng trong lai giống

Nghiên cứu thời kỳ nở hoa của các loài Xoan ta, Xoan chịu hạn Ninh Thuận tại Hà Nội, Ninh Thuận (2006 – 2008) cho thấy các loài này có thời gian hình thành nụ hoa, nở hoa và quả chín khác nhau khá rõ rệt. Có thể lấy số liệu thu thập năm 2007 làm thí dụ:

– Xoan ta có thời kỳ bắt đầu hình thành nụ khi vừa kết thúc nẩy lộc cuối tháng 1 đầu tháng 2, thời gian nở hoa từ ngày 22 tháng 2 đến ngày 29 tháng 3. Thời kỳ nở hoa kéo dài trên 1 tháng, thời gian quả chín tháng 11 và 12 cùng năm, khi chín quả vẫn treo trên cây đây là đặc điểm thuận lợi để thu hái quả chín. Thời gian từ lúc hình thành nụ đến lúc quả chín kéo dài 11 tháng.

– Xoan chịu hạn Ninh Thuận bắt đầu hình thành nụ đầu tháng 2, nở hoa ngày 5 tháng 4 đến 3 tháng 5, thời kỳ nở hoa kéo dài gần 1 tháng, thời gian quả chín tháng 7, thời gian lúc hình thành nụ đến lúc quả chín là 5 tháng.

Như vậy giữa Xoan ta và Xoan chịu hạn Ninh Thuận không có thời gian nở hoa cùng nhau. Vì thế, muốn tạo ra giống lai giữa 2 loài này phải thu hạt phấn cất trữ và dùng phương pháp thụ phấn có kiểm soát, nói cách khác, phải tiến hành lai giống nhân tạo.

2.2 Ảnh hưởng của phương thức thụ phấn đến phát triển của hạt

Xác định khả năng sử dụng bao cách ly trong quá trình lai giống cũng như khả năng tự thụ phấn khi chụp bao cách ly là một việc cần thiết trong lai giống có kiểm soát. Số liệu nghiên cứu cho thấy ở các công thức thụ phấn có kiểm soát của các loài xoan có tỉ lệ đậu quả rất thấp, cao nhất chỉ đạt 16,6% và thấp nhất chỉ đạt 0,1%. Trong 79 phép lai có 10 phép lai trong loài là đậu quả và 19 phép lai khác chi cũng đậu quả, tổng số hạt thu được là 689 hạt. Sinh trưởng các cây lai khác chi cũng như lai trong loài không có gì khác biệt, tuy nhiên các các cây lai trong tổ hợp lai này chỉ thể hiện có ưu thế ở giai đoạn vườn ươm còn khi ra rừng trồng chưa thấy biểu hiện của ưu thế lai về sinh trưởng so với các giống bố mẹ của chúng.

Hình thái lá của cây lai khác chi chịu ảnh hưởng của tế bào chất, hay nói cách khác là khi cây mẹ là Xoan ta còn cây bố là Xoan chịu hạn Ninh Thuận thì lá của cây lai nghiêng về mẹ tức là lá kép lông chim 2 lần, còn khi mẹ là Xoan chịu hạn Ninh Thuận bố là Xoan ta cây lai có lá kép lông chim 1 lần, giống lá của cây mẹ. Các nghiên cứu về sự hình thành lá và phân hóa lá của cây lai mẹ là Xoan ta bố là Xoan chịu hạn Ninh Thuận và ngược lại cho thấy không có gì khác biệt về sự hình thành lá

3. Phân tích đa dạng di truyền các xuất xứ Xoan ta và Xoan chịu hạn Ninh Thuận

– Kết quả cho thấy về độ dài của sản phẩm PCR ở các cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận với cả 2 mồi lục lạp đều nhận được phân đoạn đặc trưng và không có đa hình. Điều này cho thấy mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các cây trội đã chọn lọc. Để có thể phân tích sâu hơn về sự khác nhau giữa các cây trội đã chọn lọc trong xây dựng vườn giống hữu tính và vô tính, sản phẩm PCR với mồi lục lạp atpB – rbcL được cắt với enzym TaqI với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự ADN, kết quả thể hiện trong hình 5. Sau khi cắt enzym cũng không xuất hiện đa hình, điều này cho thấy mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận trong rừng tự nhiên ở 6 xã của 2 huyện thuộc tỉnh Ninh Thuận.

– Qua các kết quả phân tích với các mồi RAPD và lục lạp cho thấy chỉ có sự khác biệt nhỏ ở mức độ gen nhân, có thể là do tác động của điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của từng vùng cụ thể.

3.2 Phân tích đa dạng di truyền các xuất xứ Xoan ta

Tách chiết ADN tổng số từ lá xoan ta: theo phương pháp CTAB của (Doyle và Doyle, 1987) có cải tiến. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 0,9%. Kết quả cho thấy nồng độ ADN dao động từ 350 đến 710 ng/µl. Tỉ lệ OD₂₀₆/OD₂₈₀ của 29 mẫu xoan ta dao động từ 1,8 đến 2,0. Khoảng biến động này cũng đều nằm trong phạm vi cho phép (1,8 – 2,0). Kết quả này khẳng định các ADN tách chiết được hoàn toàn tương đối sạch và đủ tiêu chuẩn cho phân tích tiếp theo.

B. NHẬN BIẾT CON LAI VÀ BỐ MẸ BẰNG CHỈ THỊ LỤC LẠP

Sản phẩm PCR gennom của 7 dòng cây xoan với cặp mồi 16S sau đó được cắt bằng enzym TaqI có thể cho thấy sự khác biệt di truyền của 1 số cặp con lai với bố mẹ (hình 18). Cụ thể, sản phẩm PCR của cây bố mẹ là SS28, NT6 khi cắt bằng enzym TaqI đều cho hai băng giống nhau có kích thước là 600bp, 800bp. Tuy nhiên, ở mẫu con lai NT6SS28 khi cắt bằng enzym này ngoài hai băng có kích thước giống như của bố mẹ (600bp, 800bp), lại có thêm hai băng kích thước 300bp, 500bp. Nguyên nhân có thể do quá trình trao đổi tréo khi kết hợp ADN của hai cây bố mẹ trong quá trình phân bào. Như vậy có thể dựa vào những cây con lai có bốn băng kích thước: 300bp, 500bp, 600bp, 800bp để phân biệt với cây bố mẹ chỉ có hai băng: 600bp, 800bp. Tương tự, sản phẩm PCR với cặp mồi 16S của ADN cây bố mẹ là NT83 và BV22 khi cắt bằng enzym TaqI cũng cho hai băng giống nhau có kích thước là 600bp, 800bp, nhưng ở con lai NT83BV22 chỉ cho hai băng 300bp, 500bp mà lại không có hai băng 600bp, 800bp như cây bố mẹ. Vì vậy, dựa vào sự xuất hiện chỉ hai băng có kích thước 300bp, 500bp chưa thể phân biệt được con lai và bố mẹ trong cặp lai NT83 và BV22, để có thể phân biệt được con lai và bố mẹ cần phân tích thêm với các mồi chỉ thị phân tử khác. Như vậy với cặp mồi 16S và cắt bằng enzym TaqI có thể phân biệt cặp lai SS28 và NT6.

PHẦN II: CÁC KẾT QUẢ VỀ KHẢO NGHIỆM GIỐNG VÀ NHÂN GIỐNG

A. SINH TRƯỞNG CỦA CÁC GIA ĐÌNH XOAN TA VÀ XOAN CHỊU HẠN

1. Sinh trưởng của các gia đình Xoan ta tại Đắc Lắc (8/06 -12/09)

2. Sinh trưởng của các gia đình Xoan ta tại Bình Định (11/2007 – 11/2009)

3. Sinh trưởng các gia đình Xoan chịu hạn tại Ninh Sơn – Ninh Thuận

B. SINH TRƯỞNG CÁC GIỐNG XOAN LAI TẠI CẦU HAI PHÚ THỌ

C. NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG SINH DƯỠNG

1 NGHIÊN CỨU GHÉP CÂY CÓC HÀNH

2. THÍ NGHIỆM NHÂN GIỐNG CÁC TỔ HỢP XOAN LAI BẰNG HOM

IV. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

A. KẾT LUẬN

Đề tài đã chọn được 167 cây trội Xoan ta và 50 cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận, các cây trội này đều có hình dáng thân đẹp và chất lượng cây đáp ứng được tiêu chuẩn của chọn lọc cây trội trong rừng tự nhiên và cây phân tán.
1. Về phân tích chỉ thị phân tử:

– Các gia đình Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa), Xoan ta (M. azadarach) nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp.

– Có 6 cặp gia đình Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) có hệ số tương đồng gần bằng 1 (từ 0,978 đến 0,981) là cặp NT38 và NT54, NT8 và NT11, NT53 và NT50, NT13 và NT22, NT19 và NT56, NT42 và NT58.

Nghiên cứu về lai giống

– Mùa nở hoa của Xoan ta vào tháng 2-3 quả chín vào tháng 11-12 cùng năm, còn mùa nở hoa của Xoan chịu hạn Ninh Thuận vào tháng 4-5 quả chín 6-7 cùng năm.

– Trong lai giống xoan khi khử đực và chụp bao cách ly không thấy đậu quả. Chụp bao cách ly khi hoa sắp nở cũng không thấy đậu quả. Điều đó chứng tỏ các loài xoan tuy có cấu tạo hoa lưỡng tính, song hoàn toàn bất thụ khi tự thụ phấn cùng hoa trong bao cách ly. Nói cách khác việc chụp bao cách ly trước và sau khi thụ phấn có kiểm soát là hoàn toàn có tác dụng và cần thiết trong lai giống.

– Đề tài đã lai thành công được 29 tổ hợp lai trong loài và khác chi, trong đó có 19 tổ hợp lai là khác chi ( hai chi là Azadirachta và Melia của 2 loài là A. excelsa và M. azadarach )tổng số hạt thu được là 689 hạt lai.

– Có thể dựa vào cặp mồi 16S và cắt bằng enzym TaqI có thể phân biệt con lai NT6SS28 với bố mẹ của chúng (SS28 và NT6) dựa vào sự xuất hiện của hai băng có kích thước 300bp, 500bp.

Đánh giá về sinh trưởng các gia đình xoan và giống xoan lai

– Tại tuổi 3 có thể chọn được 6 gia đình là SS7, BV45, BV28, SS26, BV58 và SS25 có thể tích thân cây đạt từ 25dm³/cây đến 30dm³/cây. Tăng trưởng bình quân về đường kính đạt 3cm/năm và chiều cao đạt xấp xỉ 3m/năm.

– So sánh sinh trưởng giữa các cây lai và bố mẹ cho thấy tại vườn ươm có khác biệt về sinh trưởng nhưng ở rừng trồng trên 1 năm chưa thấy sự khác biệt về sinh trưởng.

Về nhân giống:

– Về khả năng nhân giống (ghép): Có thể áp dụng các phương pháp ghép áp và ghép nêm để nhân giống vô tính cây Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa).

– Những nhận định sơ bộ về nghiên cứu nuôi cây mô cho các giống xoan lai như sau:

+ Khử trùng bẳng HgCl2 nồng độ 0.05% thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch cao đạt trên 80%

+ Môi trường nhân chồi có nồng độ BAP 0.2mg/l và IBA 0.01 mg/l là môi trường hữu hiệu cả về chất lượng, số lượng chồi và ý nghĩa kinh tế.

+ Môi trường ra rễ hiệu quả ở nồng độ NAA 1mg/l và IBA 2mg/l

+ Không có sự khác biệt về khả năng nhân giống giữa 3 tổ hợp lai được nuôi cấy.

B. TỒN TẠI

Do thời gian có hạn nên đề tài mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá sinh trưởng của các gia đình Xoan chịu hạn Ninh Thuận, Xoan ta, xoan lai ở giai đoạn 1- 3 tuổi, do vậy những kết luận về sinh trưởng mới có tính chất bước đầu.

C. KHUYẾN NGHỊ

Tiếp tục theo dõi khảo nghiệm để có kết luận chính xác hơn về các gia đình Xoan chịu hạn Ninh Thuận, Xoan ta, xoan lai đã được chọn lọc.
Đây mới là các nghiên cứu bước đầu về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi RAPD và 2 mồi lục lạp). Để có thể phân tích sâu sắc và toàn diện hơn về sự khác nhau giữa các dòng Xoan chịu hạn Ninh Thuận, nên tiếp tục phân tích các mẫu với một số mồi lục lạp khác và tất cả các sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cần được cắt với các enzym giới hạn với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự cpADN ( chloroplast DNA).

V. TÀI LIỆU THAM KHẢO:

A.K. Singh, S. Chand, S. Pattnaik & P. K. Chand, 2002. Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of Dalbergia sissoo Roxb., a timber yielding tree legume. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 68: 203–209.
Agro Forestry Tree Database (2006), A tree species reference and selection guide, Azadirachta excelsa, http://www.worldagroforestry.org.
Chung SM., Jack ES. (2003), The development and evaluation of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequence regions in a diverse array of plant taxa. Theor Appl Genet (2003) 107: 757-767.
Devos N., Tyteca D., Raspe O., Wesselingh RA., and Jacquemart AL. (2003), Patterns of chloroplast diversity among western European Dactylorhiza species (Orchidaceae). Plant Syst Evol 243: 85-97
Danh mục các loài thực vật Việt Nam tập II, nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội 2003.
Davidson. J, (1998). Domestication and breeding programme for Eucalyptyus in the Asia-Pacific region. Food and agriculture organization of the united nations. Philippines, 252 trang.
David F. Marshall. 1999. A preliminary report of the application of AFLP and microsatellitepolymorphism to investagatethe extent and partition of genetic variation in a sample of lines of Melia azdarach. SCRI 4.
Fang DQ., Roose ML., Federici CT. (1997), Fingerprinting trifoliate orange germ plasm accessions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers. Theoretical and applied genetics 95: 211-219.
Ferreira AR., Keim P (1997), Genetic Mapping of Soybean [Glycine max (L.) Merr.] Using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Plant Mol Biol Rep, 15(4): 335- 354.

10. Heinze Berthold (2007), A database of PCR primers for the chloroplast genomes of higher plants. Plants Methods 2007: 3-4.

11. Nguyễn Thuý Hạnh (2005), Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số chi và loài cây họ dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt nam bằng chỉ thị RAPD và AND lục lạp. Luận án cao học.

12. Phạm Hoàng Hộ, 1991. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Montréal.

13. Heinze Berthold (2007), A database of PCR primers for the chloroplast genomes of higher plants. Plants Methods 2007: 3-4.

14. Nguyễn Thuý Hạnh (2005), Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số chi và loài cây họ dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt nam bằng chỉ thị RAPD và AND lục lạp. Luận án cao học.

15. Nguyễn Tích và Trần Hợp , 1971. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông thôn, Hà Nội.

16. Trần Đình Lý, 1993. 1900 cây có ích. Nhà XB Thế Giới Hà Nội

17. Levi A. and Rowland LJ. (1997), Identifying blueberry cultivars and evaluating their genetic relationships using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat-(SSR-) anchored primers. Journal of the American Society for Horticultural Science 122: 74-78.

18. Lee. S. L, Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H. (2000), “Mating System parameters in a Tropcal Tree Species, Shorea leprosula Miq. (Dipteerocarpaceae), from Malaysian Lowland Dipterocarp Forest”. Biotropica 32(4a): 693 – 702.

19. Mace ES., Lester RN., Gebhardt CG. (1999), AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae), Theor. Appl. Genet. 99: 626 – 633.

20. McMillan E., Sun G. (2004), Genetic relationships of tetraploid Elymus speciess and their genomic donor speciess inferred from polymerase chain reaction – restriction length polymorphism analysis of chloroplast gene regions. Theor Appl Gent 108: 535-542.

21. Mohanty A., Martin JP., Aguinagalde I. (2001), Chloroplast DNA study in wild populations and some cultivars of Prunu avium L. Theor Appl Genet 103: 112-117.

22. Moncur. M. W. (1995). Techiques for Pollinating Eucalypts. ACIAR Technical Reports No.34. 20 trang.

23. Moncur. M. W, Gunn B.V, (1995) Seed development and germination respones of Melia azdarach var. australiasica. Tropical Tree Seed Research. Aciar project No. 28.

24. Nagaoka T. and Ogihara Y. (1997), Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical and applied genetics 94: 597-602.

25. Navascues M., Emerson BC. (2005), Chloroplast microsatellites: measure of genetic diversity and the effect of homoplasy. Molecular Ecology 14: 1333-1341.

26. Nicolosi E, Deng. Z. N, Gentile .A, La Malfa. S, Continella. G, Tribulato. E. (2000), ”Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers”. Theor. Appl. Genet., 100, pp. 1155-1166. Viện ĐTQH Rừng, 1980-1985. Cây gỗ rừng VN. Nhà XBNN Hà Nội

27. Olivier Monteuuis & Marie-Claude Bon, 2000. Influence of auxins and darkness on in vitro rooting of micropropagated shoots from mature and juvenile Acacia mangium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 173–177

28. Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Nguyễn Thị Hải Hà, Lê Duy Thành, Nguyễn Văn Viết (2004), Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống định hướng nông lâm nghiệp miền núi. Thái Nguyên 23/9/2004: 571-574.

29. Pannee Denrungruang (2005), The Composition of Fatty Acids from Azadirachta excelsa Seed, Forest Products Research and Development Division, Royal Forest Department, Chatuchak, Bangkok 10900, Thailand.

30. Richar. G, Olmstead, Jeffrey. D, Palmer (1994), “Chloroplast DNA Systematics: Areview of methods and data anlysis”. American Journal of Botany, Vol. 81, No. 9, 1205 – 1224.

31. Rohlf F. J. (1993), “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version 1.80. Applied Biostatitics, New York.

32. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W, (1994), “Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp. 5466-5470
33. Schmutterer H. and M. Doll (1993), The marrango or Phillipine neem tree, Azadirachta excelsa (= A.integrifoliola): A new source of insecticide with growth regulating properties. Phytoparasitica, 21(1): 79 – 86.

34. Shinoza K., Ohme M., Tanaka M., Wakasugi T., Hayashida N., Matsubayashi T., Zaita N., Chunwongse J., ObokataJ., Yamaguchi-Sinozaki K., Ohto C., Torazawa K., meng BY, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Ya – mada K, Meng BY, Sugita M. (1986), The complete nucleotide sequence of the tobacco horoplast genome. Plant Mol Biol Rep 4: 110-147.

35. S. Duttagupta, India and Yasuomi Ibaraki, Japan (editors), 2006. Plant Tissue Culture Engineering (trang 15-28). Published by Springer

36. Shinoza K., Ohme M., Tanaka M., Wakasugi T., Hayashida N., Matsubayashi T., Zaita N., Chunwongse J., ObokataJ., Yamaguchi-Sinozaki K., Ohto C., Torazawa K., meng BY, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Ya – mada K, Meng BY, Sugita M. (1986), The complete nucleotide sequence of the tobacco horoplast genome. Plant Mol Biol Rep 4: 110-147.

37. Tsumura Y., Ohba K., Strauss SH. (1996), Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theoretical and applied genetics 92: 40-45.

38. Vụ KHCN, Bộ NN-PTNT, 2000. Tên cây rừng Việt Nam. Nhà XB Nông nghiệp, Hà Nội

39. Welsh J., McClelland M. (1991), Fingerprinting genome using PCR with arbitrary primer, Nucleic Acids Res, 18, pp. 7213-7218.

40. Williams J.G.K., Kubelik A.E., Levak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990), DNA polymorphisms amplified by arbitrary primer are useful as genetic markers, Nucleic Acids Res, 18, pp. 6531-6535.

41. William, E. R and Matheson, A. C., (1994). Experimental Design and Analysis for Use in Tree Improvement. CSIRO, Melbourne and ACIAR, Canberra, 174 trang.